卵葉泥炭蘚莖尖包埋玻璃化法超低溫保存研究

許丹爾，高雪笛，李秋萍，戚 鈺，韋玉梅，盧春紅，王 健*，朱瑞良

(1 華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海200241；2 中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)學(xué)院植物生理生態(tài)研究所，上海200032；3 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都610000；4 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所 廣西喀斯特山區(qū)植物保護及生態(tài)恢復(fù)重點實驗室，廣西桂林541006)

隨著全球氣候的變化及人類不合理的開發(fā)利用，生物多樣性正以前所未有的速度喪失；而全球性生物多樣性破壞和生態(tài)環(huán)境惡化正逐漸瓦解地球上的生命支持系統(tǒng)，威脅到生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及人類的生存和發(fā)展[1]。因而，生物多樣性和生物種質(zhì)資源保護迫在眉睫。

生物多樣性保護措施主要包括就地保護和遷地保護兩種。當(dāng)生物生存的野外環(huán)境遭受嚴重破壞，很難通過建立自然保護區(qū)和國家公園等就地保護措施實現(xiàn)保護的情況下，遷地保護將是一種更好的選擇。在遷地保護中，種質(zhì)資源庫因其性價比高，早就被西方國家所重視，例如美國早在1946年就建立了國家植物種質(zhì)系統(tǒng)，英國的“千年種子庫”自1997年啟動以來，已實現(xiàn)了保存全部的英國植物物種和全球10%的植物物種的目標。近年來，超低溫保存技術(shù)在植物種質(zhì)資源保存研究方面應(yīng)用廣泛。超低溫一般是指液氮溫度(-196 ℃)，活細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和生長活動在這種溫度下幾乎完全停止，不會引起遺傳性狀的改變，也不會改變形態(tài)發(fā)生的潛能[2]。

苔蘚植物是一類以孢子作為有性生殖產(chǎn)物和長距離傳播方式的原始高等植物，全世界估計有21 000余種，是高等植物中僅次于種類最多的被子植物的類群之一，是生物多樣性的重要組成部分。作為自然界的拓荒者，苔蘚植物具備強大的吸水能力，在防止水土流失及維持生態(tài)系統(tǒng)平衡方面發(fā)揮著非常重要的作用。最新的研究還表明，苔蘚植物是地球上首個穩(wěn)定的氧氣來源，使得智能生物及人類得以蓬勃發(fā)展，可以說沒有苔蘚植物就不會有我們?nèi)祟怺3]。由于生態(tài)環(huán)境惡化已成為當(dāng)今世界各國共同面臨的一個嚴峻問題，苔蘚植物保護因其在生態(tài)系統(tǒng)及人類生存和發(fā)展中的重要作用日漸受到各國重視，英國及北歐國家率先開展對苔蘚植物多樣性的保護研究。

泥炭蘚屬植物(Sphagnum)因其高效的孢子傳播方式，在全世界各地均有分布，約覆蓋地球陸地表面的1%；全世界共380余種，中國目前有47種，主要生長在高山沼澤、濕潤的林下或水溝邊[4-5]。泥炭蘚是世界上吸水能力最強的植物之一，其吸水量可達干重的10～25倍。因為其驚人的吸水能力及天生具備的抗菌能力，泥炭蘚已成為最具經(jīng)濟開發(fā)價值的苔蘚植物，在藥用、園藝、燃料等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致商業(yè)采收泥炭蘚日趨嚴重。由于泥炭蘚生長緩慢，一旦破壞就很難再恢復(fù)。因此，為了保護泥炭蘚，在開展對其人工種植的基礎(chǔ)上還應(yīng)開展對其遷地保護，尤其是超低溫保存方面的研究。

包埋脫水法和玻璃化法是植物種質(zhì)資源保存中常用的兩種方法。在苔蘚植物超低溫保存研究方面，國際上主要采用包埋脫水法對其配子體及原絲體進行保存[6-8]。干燥和低溫預(yù)處理是苔蘚植物配子體超低溫保存成功的關(guān)鍵，因而超低溫保存效果與其植物體在自然環(huán)境中對干燥和低溫的忍受能力緊密相關(guān)。干燥生境中的苔蘚植物不用干燥處理就可以成功實現(xiàn)超低溫保存，但生長在濕潤環(huán)境中的苔蘚植物極易受干燥處理的影響，超低溫保存后的成活率非常低[9-10]。因此，如何保存這些生長于濕潤環(huán)境中的苔蘚是超低溫保存中的一個難題。近年來報道的包埋玻璃化法彌補了包埋脫水法和玻璃化法的不足之處，既縮短了脫水時間又減輕了保護劑對細胞的毒害作用，且保存后的材料成活率高[11]，已經(jīng)在一系列植物的超低溫保存方面有了成功的先例[12-13]。能否利用這種方法保存濕潤生境中的苔蘚植物？本研究通過對脫水時間和化凍溫度等條件的摸索，采用包埋玻璃化法對卵葉泥炭蘚(S.ovatumHamp.)進行超低溫保存研究，以檢驗這一方法對于濕潤生境下生長的苔蘚植物的保存效果，為特殊生境下苔蘚植物的超低溫保存提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

卵葉泥炭蘚的配子體于2012年采自四川省阿壩藏族羌族自治州黑水縣白塔至娜姆湖途中棧道旁，土生，32°15.069′N，102°46.123′E，海拔 3 579 m。憑證標本存于華東師范大學(xué)生物博物館(HSNU)。

1.2 實驗方法

1.2.1組織培養(yǎng)獲得無菌試管苗新鮮的材料連同基質(zhì)置于培養(yǎng)皿中帶回，外包保鮮袋后置于人工智能氣候箱(溫度15 ℃，光照周期12 h明暗交替)保存，直到孢子體完全成熟后，選取飽滿有光澤的孢蒴用于實驗。參照李秋萍等的孢蒴消毒方法[14]，將消毒后的孢子進行組織培養(yǎng)獲得卵葉泥炭蘚的無菌配子體。

1.2.2低溫鍛煉參照李明軍等[15]，將繼代培養(yǎng)70 d左右的無菌配子體于4 ℃低溫下煉苗7 d。

1.2.3預(yù)培養(yǎng)參照李海兵等[16]，在無菌條件下，切取無菌配子體莖尖1～1.5 cm，放入預(yù)培養(yǎng)基(Knop+0.1 mol/L蔗糖+0.1 mol/L甘油)中，低溫下預(yù)培養(yǎng)3 d。

1.2.4包埋參照李明軍等[12]，在無菌條件下，用解剖刀切取2 mm大小的莖尖，室溫下與含3%(w/v)海藻酸鈉和0.2 mol/L蔗糖的無鈣離子改良Knop培養(yǎng)基混合，將混合液滴入含有0.1 mol/L CaCl2和0.2 mol/L蔗糖的Knop培養(yǎng)液中進行包埋，并不時輕輕搖動混合液。包埋過程結(jié)束后，固定30 min，使包埋珠變硬，即獲得球形包埋珠。每個包埋珠含1個材料。從CaCl2中取出包埋珠，用無菌水清洗2～3次，再用無菌濾紙吸去多余的水分。

1.2.5裝載參照洪森榮等[17]的方法，將包埋珠分別放入Knop+60% PVS2裝載液中(60% PVS2配比為：180 g/L甘油+90 g/L乙二醇+90 g/L 二甲基亞砜+0.2 mol/L蔗糖)于0 ℃下裝載30 min。

1.2.6脫水參照李明軍等[12]，用冰凍保護劑PVS2(300 g/L甘油+150 g/L二甲基亞砜+150 g/L乙二醇+0.4 mol/L蔗糖)在0 ℃下分別脫水0、30、60 min。

通過以上的處理可使細胞內(nèi)自由水含量減少，降低了細胞內(nèi)結(jié)冰造成的機械損傷。

1.2.7液氮保存參照洪森榮和李明軍[18]的方法，將10個處理過的包埋珠放入一個凍存管中，滴加新的冰凍保護劑PVS2，用紗布包好凍存管后迅速置于液氮中保存24 h。

1.2.8化凍洗滌參照李海兵等[16]的方法，從液氮中取出凍存管，分別放入溫度為4 ℃(CK)、40 ℃、42 ℃中化凍，化凍時間為2 min。解凍后用含0.4 mol/L蔗糖的洗滌液洗滌包埋珠2次，每次洗滌10 min。然后再用無菌水清洗2～3次，用無菌濾紙吸干水分，再接種到培養(yǎng)基上。

1.2.9恢復(fù)培養(yǎng)及成活率檢測將包埋珠轉(zhuǎn)入再生固體培養(yǎng)基Knop中，先暗培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25+2)℃，光照時間為16 h/d；記錄再生率及恢復(fù)生長的時間，并在70 d時比較超低溫保存的再生苗與常溫保存試管苗的形態(tài)指標。

再生率=包埋玻璃化超低溫保存后突破包埋珠的莖段數(shù)/保存的總莖段數(shù)×100%

1.2.10數(shù)據(jù)處理及分析實驗每次處理20個莖尖，重復(fù)3次，將未經(jīng)液氮處理的材料設(shè)為對照。采用SPSS19.0程序?qū)嶒灲Y(jié)果進行統(tǒng)計分析，均值的多重比較采用鄧肯氏(Duncan)新復(fù)極差檢驗和LSD法檢驗，檢驗水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫水時間和化凍溫度對超低溫保存的影響

2.1.1脫水時間對卵葉泥炭蘚莖尖包埋玻璃化超低溫保存的影響在包埋玻璃化保存過程中，利用玻璃化保護液即PVS2對植物材料進行最佳的脫水處理是獲得高存活率的關(guān)鍵。經(jīng)PVS2處理的組織會脫去水分，這樣在凍存中可進入玻璃化狀態(tài)，并使冷凍保護液滲入細胞而減輕在超低溫保存過程中細胞所受的傷害，從而有效地保護細胞活性。經(jīng)不同脫水時間后的材料投入液氮保存1 d，40 ℃水浴快速化凍，然后再轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基上，70 d后統(tǒng)計成活率，結(jié)果見表1。由表1可知，在0 ℃下，PVS2脫水時間不同，超低溫保存的效果也不一樣；脫水60 min的最高成活率高于脫水30 min的，且前者是后者的2.12倍，而不經(jīng)過脫水處理的包埋珠其成活率為0。說明脫水時間對超低溫保存效果具有顯著的影響。

2.1.2化凍溫度對卵葉泥炭蘚莖尖包埋玻璃化超低溫保存的影響由表2可以看出，化凍溫度對包埋玻璃化超低溫保存的效果也有影響。在以PVS2為玻璃化保護劑的條件下，經(jīng)脫水60 min，化凍溫度為40 ℃時，卵葉泥炭蘚莖尖的成活率達到最大值；當(dāng)化凍溫度繼續(xù)升高到42 ℃時，莖尖的成活率開始下降。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然40 ℃水浴快速化凍比42 ℃水浴快速化凍成活率要高，但是植物長勢及大小卻不如42 ℃水浴快速化凍的。

表1 不同脫水時間處理條件下卵葉泥炭蘚莖尖超低溫保存后再生成活率比較

注：不同小寫字母表示差異顯著(α=0.05)。下同

Note: The different normal letters stand for significant difference at 0.05 level. The same as below

表2不同化凍溫度處理條件下卵葉泥炭蘚莖尖超低溫保存后再生成活率比較

Table 2 The comparison of regeneration rate of shoot tips of S. ovatum after cryopreservation under different thawing temperatures

A. 接種后7 d的莖尖；B. 接種后14 d的莖尖；C. 接種后70 d分化成的植株；D. 接種后70 d分化成的植株(對照，常溫保存)圖1 卵葉泥炭蘚莖尖包埋玻璃化超低溫保存后植株的再生A. Shoot tips after culturing 7 d; B. Shoot tips after culturing 14 d; C. Shoot tips after culturing 70 d; D. Shoot tips after culturing 70 d (CK, stored at room temperature)Fig.1 Regeneration of shoot tips of S. ovatum after cryopreservation

形態(tài)指標Morphologicalindicator常溫保存植株P(guān)lantpreservedatroomtemperature超低溫保存后再生植株Regeneratedplantaftercryopreservation平均株高Averageheight/cm1.21±0.78a1.15±0.65a平均葉片數(shù)Averageleafnumber194.33±14.01a190.67±12.58a平均芽數(shù)Averagebudnumber9.33±3.06a8.67±2.08a

2.2 超低溫保存與常溫保存的再生植株形態(tài)指標的比較

將超低溫保存與常溫保存(25 ℃)的卵葉泥炭蘚莖尖包埋珠同時接種于Knop固體培養(yǎng)基(1%蔗糖+1%瓊脂)上培養(yǎng)，超低溫保存后的包埋莖尖先失綠再逐漸長出綠色(約14 d后逐漸出現(xiàn)綠色)，20 d開始突破包埋珠，25 d長出新葉(圖1)；而常溫保存的莖尖大部分(約92.7%)一直保持綠色， 17 d開始突破包埋珠，20 d長出新葉。70 d時測定再生植株的形態(tài)指標，結(jié)果見表3。從表3可以看出，超低溫再生植株與常溫保存植株的形態(tài)指標基本一致；經(jīng)Duncan法檢驗，其株高、葉片數(shù)和芽數(shù)均未達顯著水平。雖然液氮保存后的卵葉泥炭蘚莖尖成活率(42.41%)低于對照(68.06%)，但并未完全喪失，說明應(yīng)用包埋玻璃化法保存該種蘚類是可行的。

3 討 論

包埋玻璃化法超低溫保存過程中脫水時間非常關(guān)鍵。脫水時間過短則不能有效地降低冰點，易產(chǎn)生冰晶對化凍后的細胞造成傷害，但處理時間過長，則又有可能由于PVS2本身具有較強的毒性而使植物組織受毒害而死亡[19]。不同材料所用PVS2處理時間長短也有所不同，木薯莖尖的最適脫水時間為4 h[20]，青島百合莖尖在脫水 60 min獲得最高的成活率[13]。本研究中，脫水時間對保存效果的影響較明顯，且隨著脫水時間的延長，卵葉泥炭蘚的再生率逐漸升高。在進行包埋玻璃化超低溫保存時，除了要篩選出合適的脫水時間，還必須要篩選出符合實驗材料特性的化凍方式?；瘍龇绞绞浅蜏乇４婕夹g(shù)的關(guān)鍵，從液氮中取出的樣品，緩慢升溫時細胞內(nèi)會再次結(jié)冰，其溫度危險區(qū)域大概在-50～10 ℃。因此，在化凍時須迅速通過此溫度區(qū)域，避免細胞再次結(jié)冰而造成傷害。對于不同的材料，化凍方式也不同，一般以35～40 ℃水浴快速化凍的效果較好[21]，如長春花胚性懸浮細胞超低溫保存后在37 ℃化凍1.5 min效果最好[22]，塞爾維亞云杉胚性組織在42 ℃化凍2 min成活率達到最高[23]，甌柑愈傷組織在40 ℃水浴化凍的存活率最高[24]，懷山藥在40 ℃水浴快速化凍1～3 min成活率最高[16]。但有些木本植物的冬芽超低溫保存后必須在0 ℃低溫下化凍才能達到最好的效果[25]。可見，不同的保存材料要求的化凍溫度也不同。本研究結(jié)果表明，40 ℃水浴快速化凍是卵葉泥炭蘚的最佳化凍方式。

由于本研究的主要目的在于探索包埋玻璃化法是否適用于保存濕潤生境中的苔蘚植物，對脫水時間和化凍溫度只進行了單因素分析，同時，對于脫水與保護劑二者對保存效果的相互影響未進行探究，進一步延長脫水時間是否會導(dǎo)致植物組織受到保護劑的毒害將在接下來的研究中繼續(xù)開展。

包埋玻璃化法超低溫保存技術(shù)克服了玻璃化法和包埋脫水法兩種方法的缺點，研究證明是一種極有前途的種質(zhì)保存技術(shù)[11]。本研究僅通過對卵葉泥炭蘚包埋玻璃化超低溫保存過程中脫水時間和化凍溫度進行單因素的初步分析，就獲得了42.41%再生率。盡管Segreto等的研究表明生長在寒冷地區(qū)的苔蘚植物具有潛在的超低溫保存能力，但其所保存的2種泥炭蘚(Sphagnumgirgensohnii和S.russowii)的再生率也僅有20%[10]。因此，本研究初步證明了包埋玻璃化法對于保存濕潤生境中的苔蘚植物效果明顯。

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