妊娠小鼠子宮內(nèi)注射影響因素的研究*

★ 陳來(lái) 李俊 殷玉婷 陳麗玲 袁可望 舒坤 羅小泉 徐彭 李?yuàn)檴?/p>

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004)

現(xiàn)有用于新藥臨床前體內(nèi)藥效學(xué)研究的腫瘤動(dòng)物模型因與人腫瘤實(shí)際情況差異較大，導(dǎo)致動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床治療人腫瘤的實(shí)際情況相差較遠(yuǎn)情況較為常見(jiàn)。如能建立與人腫瘤實(shí)際情況差異小，且免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型的可能性，則可提高抗癌新藥和新療法的篩選效率。基于子宮內(nèi)移植供體細(xì)胞，可成功地誘導(dǎo)特異性免疫耐受并維持嵌合體狀態(tài)的原理，我們?cè)噲D探討在胚胎時(shí)期子宮內(nèi)注射人源腫瘤細(xì)胞，建立不會(huì)影響模型動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)其它免疫活性物質(zhì)免疫反應(yīng)的，獨(dú)能允許具有相同抗原特異性的人腫瘤移植物正常生長(zhǎng)的異種移植腫瘤動(dòng)物模型成的可能性。昆明小鼠由于繁殖周期短、多胎妊娠和抵抗力強(qiáng)，是以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本文以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討了注射天數(shù)、孕鼠經(jīng)初產(chǎn)等因素對(duì)胎鼠成活率的影響，初步確定了模型建立中子宮移植部分的關(guān)鍵因素。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18 ～ 22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)為JZDWNo：43004700007670。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.2 藥品 戊巴比妥鈉(批號(hào)為922L035)，購(gòu)自Pentobarbital sodium公司；鹽酸布比卡因(批號(hào)為D1102A)，購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑 甲醛(批號(hào)為1307132)，購(gòu)自西隴化工股份有限公司；PBS(批號(hào)為20141215)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器 拉制儀(型號(hào)為PC-1)，購(gòu)自日本成茂公司；微量注射器(型號(hào)為IM-9B)，購(gòu)自日本成茂公司；恒溫臺(tái)(型號(hào)為TP-SMZSL)，購(gòu)自日本東海希多公司。

2 方法

2.1 微量注射針的制備 用外徑1mm的毛細(xì)玻璃管拉制璃微量注射針頭，通過(guò)調(diào)整拉制儀的熔點(diǎn)溫度及拉制重量，使得拉制完成的針頭部分從錐形的開始到針尖的距離約為1cm (見(jiàn)圖1A)。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與手術(shù) 選取雄性種鼠和初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)的雌性種鼠，在交配前分開隔離飼養(yǎng)。下午1∶1合籠，第2d檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為0d。初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)的孕鼠各選取40只，隨機(jī)分為4組，分別于孕14d、15d、16d開腹腔行子宮內(nèi)注射，即向胎鼠腹腔注射20μL的無(wú)菌PBS溶液，全部胎鼠注射完成后縫合。假手術(shù)組孕鼠于孕15d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但只開腹腔不進(jìn)行胎鼠腹腔注射，直接縫合。每組孕鼠數(shù)量為10只，如發(fā)生麻醉致死的情況，則補(bǔ)足。

手術(shù)具體方法如下：孕鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液(70mg/kg)。當(dāng)孕鼠麻醉時(shí)，準(zhǔn)備好注射物，將制備好的玻璃微量注射針頭組裝到微量注射器上。確認(rèn)麻醉好后，將孕鼠放在恒溫臺(tái)上，仰臥，固定。腹部用75%酒精消毒并潤(rùn)濕，使用雙面刀片剃光腹部毛發(fā)。下腹部做1cm的縱向切口(見(jiàn)圖1B)。用濕潤(rùn)棉簽輕輕舒展筋膜，并將妊娠子宮從切口中牽出，確定左、右卵巢，記錄胎鼠數(shù)量(見(jiàn)圖1C)后將子宮放回腹腔，以使胎鼠保持溫暖。其后逐只牽出進(jìn)行注射，術(shù)中不斷用37°C預(yù)熱PBS濕潤(rùn)子宮。記錄胎鼠注射可能出現(xiàn)的出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥。

注射時(shí)用拇指和食指固定胎鼠，確定胎鼠腹腔位置后將注射針頭依次穿過(guò)子宮，羊膜和胎鼠皮膚，進(jìn)入胎鼠腹腔，每個(gè)胎鼠注射20μL PBS(見(jiàn)圖1D)。注射完成后，小心抽離注射針，將胎鼠小心放回腹腔。用5-0編織可吸收縫線縫合筋膜，5-0不可吸收縫線縫合皮膚(見(jiàn)圖1E)。于切口處皮下注射0.025%鹽酸布比卡因溶液(5mg/kg)以減少孕鼠痛苦。將孕鼠放置在保溫臺(tái)上保持體溫，直至其醒來(lái)。醒來(lái)后轉(zhuǎn)移至鋪了厚紗布的籠具里，并置于安靜的區(qū)域直到生產(chǎn)。

第二天檢查孕鼠有無(wú)陰道出血、腹部收縮或煩躁等流產(chǎn)征兆。其后每天觀察，注意傷口紅腫、發(fā)炎、傷口分離和感染等癥狀。記錄每組孕鼠分娩及胎鼠成活及體重情況。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS17.0 軟件包分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)評(píng)價(jià)整體性差異，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 手術(shù)并發(fā)癥 3只孕鼠因手術(shù)麻醉過(guò)量死亡(初產(chǎn)1假手術(shù)組、初產(chǎn)16d注射組和經(jīng)產(chǎn)16d注射組各1只)，初產(chǎn)孕鼠手術(shù)時(shí)妊娠胎鼠數(shù)量為6～18只，經(jīng)產(chǎn)孕鼠為8～20只(見(jiàn)表1)。

除假手術(shù)組外，各組均有出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥，各組并發(fā)癥與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01)；初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)各注射時(shí)間點(diǎn)組之間，以及相同注射時(shí)間的初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)組之間無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表1)。

3.2 妊娠結(jié)局 因正常昆明小鼠生產(chǎn)在孕18～20d之間，故將生產(chǎn)天數(shù)少于18d孕鼠認(rèn)定為早產(chǎn)孕鼠。共有3只因難產(chǎn)死亡(初產(chǎn)14d注射組、初產(chǎn)15d注射組和經(jīng)產(chǎn)14d注射組各1只)，較初產(chǎn)孕鼠相比，經(jīng)產(chǎn)孕鼠出現(xiàn)難產(chǎn)死亡的情況有所減少(見(jiàn)表2)。

各注射組的胚胎丟失率較假手術(shù)組低，具有顯著性差異(P<0.01)。初產(chǎn)孕鼠各注射組間的胚胎丟失率無(wú)顯著差異，但相同注射時(shí)間的初產(chǎn)孕鼠的胚胎丟失率較經(jīng)產(chǎn)組低，并且孕14d注射的經(jīng)產(chǎn)組和初產(chǎn)組間有顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

4 討論

Burnet提出，體內(nèi)存在為數(shù)眾多具有免疫活性的細(xì)胞克隆，每一個(gè)克隆細(xì)胞都具有其特異的、能與其相應(yīng)抗原決定簇起反應(yīng)的受體。在胚胎時(shí)期體細(xì)胞突變頻繁，體內(nèi)已具有針對(duì)多種抗原的、眾多特異性淋巴細(xì)胞克隆，此時(shí)若與某種自身的或人工導(dǎo)入的抗原相遇，與其相應(yīng)的淋巴細(xì)胞克隆即被破壞或抑制，出生后即對(duì)胚胎期曾接觸過(guò)的抗原形成耐受，即獲得性免疫耐受，而對(duì)胚胎時(shí)期從未接觸過(guò)的抗原仍產(chǎn)生免疫應(yīng)答。研究表明，采用子宮內(nèi)注射異體、甚至異種細(xì)胞的方法，可成功地誘導(dǎo)免疫耐受[1-2]并在移植排斥研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。且子宮內(nèi)注射誘導(dǎo)移植耐受還具有所需外源性細(xì)胞相對(duì)較少、母體內(nèi)環(huán)境可防止微生物侵襲等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)此我們認(rèn)為：采用人源細(xì)胞進(jìn)行子宮內(nèi)注射預(yù)處理，誘導(dǎo)胎鼠對(duì)人腫瘤抗原產(chǎn)生特異性免疫耐受，即讓胎鼠的免疫系統(tǒng)將人腫瘤抗原認(rèn)為是自身抗原，則出生后的小鼠會(huì)將具有相同抗原特異性的人腫瘤細(xì)胞認(rèn)為是自身的組織細(xì)胞，使之順利在其體內(nèi)成瘤，同時(shí)不會(huì)影響自身免疫系統(tǒng)對(duì)其它免疫活性物質(zhì)的免疫反應(yīng)，從而解決正常動(dòng)物對(duì)異種腫瘤的免疫排斥難題。

注:A： 微量注射針的制備；B：下腹部做縱向切口；C：用棉簽將妊娠子宮從切口中牽出，確?？吹剿刑ナ螅籇：胎鼠腹腔注射；E：縫合筋膜及皮膚

圖1 子宮內(nèi)注射關(guān)鍵步驟

注:與假手術(shù)組比較，**P<0.01。

表2 各組孕鼠妊娠結(jié)局的比較(n=10)

存活乳鼠數(shù)(%)與假手術(shù)組比較，**P<0.01；存活乳鼠數(shù)(%)與初產(chǎn)孕鼠孕14天注射組比較，§P<0.05。

基于上述觀點(diǎn)或假定，我們擬建立昆明小鼠子宮內(nèi)注射方法。在注射部位的選擇上，我們采用了胎鼠腹腔注射。劉英等[4]采用胎鼠腹腔注射成功地建立了人臍血造血干細(xì)胞宮內(nèi)移植的小鼠模型，其推測(cè)宿主腹腔的間皮細(xì)胞可提供支架基質(zhì)作用，使腹腔如同一個(gè)造血干細(xì)胞庫(kù)，不斷地把造血干細(xì)胞輸送到血循環(huán)。該原理同樣適用模型建立中擬注射的人腫瘤細(xì)胞。在注射時(shí)間的選擇上，考慮到過(guò)早注射對(duì)胎鼠的損傷較大，而越晚注射則誘導(dǎo)的免疫耐受效果越差，因此在保證胎鼠存活率的前提下盡量提前注射時(shí)間，確定注射時(shí)間范圍在孕14～16d之間，本實(shí)驗(yàn)確定了該時(shí)間范圍，注射操作對(duì)胎鼠存活率無(wú)明顯影響，可作為后續(xù)研究?jī)?yōu)化胎鼠腹腔注射時(shí)間的選取范圍。在孕鼠選擇上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孕14d注射組經(jīng)產(chǎn)孕鼠較初產(chǎn)孕鼠的胎鼠成活率明顯增加，難產(chǎn)死亡的數(shù)量也有所減少，可能經(jīng)產(chǎn)孕鼠的生育耐受性、適應(yīng)性和經(jīng)驗(yàn)上都優(yōu)于初產(chǎn)孕鼠，因此采用經(jīng)產(chǎn)孕鼠可顯著提高子宮內(nèi)注射后胎鼠存活率，后續(xù)研究將采用經(jīng)產(chǎn)孕鼠。

在子宮內(nèi)注射后出現(xiàn)的流產(chǎn)和早產(chǎn)與操作技術(shù)密切相關(guān)，主要是術(shù)中對(duì)胚胎操作的過(guò)度壓迫、子宮復(fù)位不佳和手術(shù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的。為減少并發(fā)癥的發(fā)生，我們采取了以下措施：①采用玻璃毛細(xì)胞拉制針頭，使進(jìn)針損傷降至最低，羊水不易漏出。②進(jìn)針時(shí)盡量避開血管和胎盤，動(dòng)作輕柔，以減少出血的發(fā)生。③經(jīng)胎鼠腹腔途徑時(shí)，調(diào)整胎鼠位置，使其充分暴露腹部后再進(jìn)針，以減少對(duì)胎鼠的損傷。④術(shù)后給與鎮(zhèn)痛藥，減少孕鼠的不適。⑤整個(gè)手術(shù)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作，加強(qiáng)術(shù)后的保暖和護(hù)理措施。實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的提高和熟練可明顯降低流產(chǎn)、早產(chǎn)和機(jī)械性損傷的發(fā)生。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們確認(rèn)了后續(xù)研究中的關(guān)鍵因素，優(yōu)化、改進(jìn)了操作技術(shù)，有助于研究的順利進(jìn)行。

[1]Jeng Chang Chen, Liang Shi Ou, Hsiu Yueh Yu, et al. Allogeneic lymphocytes exerted graft-versus-host rather than tolerogenic effects on preimmune fetuses[J].J Surg Res, 2013, 183(1): 405-411.

[2]Kristin L MacArthur, Catherine H Wu, George Y Wu. Animal models for the study of hepatitis C virus infection and replication[J].World J Gastroenterol, 2012, 18(23): 2 909-2 913.

[3]Jeng Chang Chen, Ming Ling Kuo, Liang Shiou Ou, et al. Characterization of tolerance induction through prenatal marrow transplantation: the requirement for a threshold level of chimerism to establish rather than maintain postnatal skin tolerance[J].Cell Transplant, 2010, 19(12): 1 609-1 622.

[4]劉英，莊廣倫，游澤山，等. 經(jīng)胎鼠腹腔途徑進(jìn)行人臍血造血干細(xì)胞宮內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(1)：22-24, 28.