液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)苯二氮卓類藥物的臨床應(yīng)用*

★ 熊周芳 涂鳳蓮 汪元符

(1.南昌市新建區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 南昌 330100；2.南昌市食品藥品檢驗(yàn)所 南昌 330038)

苯二氮卓類藥物(Bzds)是臨床應(yīng)用最廣泛的鎮(zhèn)靜催眠類藥物，同是也是受管制的精神類藥物。Bzds的藥理活性來自于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABAA受體的調(diào)節(jié)作用。Bzds在α-和γ-亞基表面與受體結(jié)合，使受體處于鎖定狀態(tài)，給予神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)更高的親和力，增加氯離子通道開放的頻次，從而發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠和抗焦慮的作用。Bzds具有親脂性，血漿蛋白結(jié)合率高，但藥代動(dòng)力學(xué)差異很大，半衰期表現(xiàn)為短(<12h)、中(12～24h)、長(>24h)，與給藥方式、給藥途徑、藥物劑型、個(gè)體代謝差異都有關(guān)。Bzds具有較窄的治療窗，常有藥物濫用并造成急性中毒。臨床使用Bzds時(shí)非常有必要開展藥物監(jiān)測(cè)。通過文獻(xiàn)檢索[1-8]，結(jié)果表明：以全血、尿液及其他(動(dòng)物飼料、保健食品)為基質(zhì)，己建立一系列相關(guān)Bzds藥物檢測(cè)方法，樣品前處理一般采用液-液分配萃取或SPE小柱固相萃取，儀器方法有液相色譜法、LC-MS/MS法、GC-MS/MS法等。本文以全血、尿液、唾液為基質(zhì)，采用QuEChERS方法處理生物樣本，結(jié)合UPLC-MS/MS，建立了QuEChERS-超高效液相色譜(UPLC)-多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)-條件觸發(fā)(IDA Criteria)-增強(qiáng)子離子掃描(EPI)的檢測(cè)方法，可同時(shí)定性與定量測(cè)定Bzds(氯氮卓，咪噠唑侖，硝西泮，艾司唑侖，奧沙西泮，勞拉西泮，阿普唑侖，三唑侖，地西泮)，為臨床監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

AB Sciex 4000 Qtrap質(zhì)譜儀、ekspert ultraLC100超高效液相色譜儀(美國AB公司)；METTLER TOLEDO XS105電子分析天平(瑞士Mettler公司)；IKA VIBRAX VXR basic型旋渦混合儀(德國IKA公司)；Hettich Rotina 380R 1706型冷凍離心機(jī)(德國Hettich公司)；Reeko30位自動(dòng)氮吹儀(廈門寶特有限公司)；Büchi Syncore 12位平行蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司)；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Thermo連續(xù)可調(diào)式精密移液器(20～200 μL及100～1000 μL)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Millipore超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

試劑：乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸銨(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁公司)；甲酸(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁公司)；無水硫酸鎂(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁公司)；無水醋酸鈉(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁公司)；無水硫酸鈉(優(yōu)級(jí)純，阿拉丁公司)；C18(粒度約80 μm，Agela公司)；PSA(粒度約60 μm，Agela公司)；GC(粒度約70 μm，Agela公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氯氮卓(CAS：58-25-3，批號(hào)：171248)；馬來酸咪達(dá)唑侖(CAS：59467-94-6，批號(hào)：171250)；硝西泮(CAS：146-22-5，批號(hào)：171217)；艾司唑侖(CAS：29975-16-4，批號(hào)：1219)；奧沙西泮(CAS：604-75-1，批號(hào)：1229)；勞拉西泮(CAS：846-49-1，批號(hào)：171253)；阿普唑侖(CAS：28981-97-7，批號(hào)：171218)；三唑侖(CAS：28911-01-5，批號(hào)：171230)；地西泮(CAS：439-14-5，批號(hào)：171225)；均來源于中國食品藥品檢定研究院。

樣品：全血(外周血)、尿液與唾液，方法建立采用來源于健康人體的生物樣本，并監(jiān)測(cè)了近兩年來9例住院患者樣本，患者年齡18～55，病情及診斷為先兆流產(chǎn)、失眠、神經(jīng)管能癥、神經(jīng)衰弱等，給藥地西泮，病例號(hào)：65456、71431、72834、73522、73963、74026、74425、74723、74681，對(duì)應(yīng)編號(hào)為①～⑨，于給藥后1h采樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 超高效液相色譜分析條件 分析柱：Waters Atlantis T3 C18，100mm×2.1mm，3μm。柱溫：40 ℃。流速：0.2mL/min。進(jìn)樣量：5μL。流動(dòng)相：A為含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸銨水溶液，B為乙腈。按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜分析條件 電噴霧離子源(ESI)：正離子模式(ESI+)。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)-條件觸發(fā)(IDA Criteria)-增強(qiáng)子離子掃描(EPI)。掃描范圍：50 Da～650 Da。氣簾氣壓力：30 Pa。碰撞氣密度：中。電離噴霧電壓：5500 V。離子源溫度：500 ℃。霧化氣壓力：60 Pa。輔助氣壓力：55 Pa。界面加熱狀態(tài)：開啟。離子對(duì)選擇見表2。

表2 質(zhì)譜分析

注:*為定量離子，另一個(gè)為定性離子。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 取氯氮卓、馬來酸咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、三唑侖、地西泮標(biāo)準(zhǔn)品各約10 mg，精密稱定，以乙腈制成每1 mL中各含氯氮卓、咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、三唑侖、地西泮1 mg的溶液作為混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，再以乙腈稀釋制成每1 mL中各含10 μg的溶液作為混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。取混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液以含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液按一定比例稀釋，可得到各含0.5，1.0，2.0，5.0，10，25，50，100，200 ng/mL的空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。精密量取此標(biāo)準(zhǔn)系列工作液200 μL與等體積空白樣品混勻，按2.4 供試品溶液的制備方法制成200 μL，即得不同基質(zhì)的工作用標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取新鮮檢材，以QuEChERS方式凈化。

提取：精密量取全血(外周血)、尿液或唾液等不同樣品各200μL置5mL離心管中，加入1mL超純水，渦旋30s使分散均勻，加入150 mg無水硫酸鎂與50 mg無水醋酸鈉，渦旋30s使分散，再加入2mL含0.1%甲酸的乙腈，渦旋3 min進(jìn)行提取，然后在4℃以10000r/min離心5min，分取乙腈層，重復(fù)提取一次，合并2次的乙腈提取溶液置另一5mL離心管中待凈化。

凈化：加入50mg無水硫酸鈉，100 mg C18，50 mg PSA與50 mg GC，渦旋5 min使充分分散達(dá)到凈化目的，其中C18可吸附磷酯類物質(zhì)，PSA可吸附脂肪酸類物質(zhì)，GC可吸附色素，然后在4℃以10000r/min離心5min，分取乙腈溶液在45 ℃平行蒸發(fā)或氮吹至干，冷卻至室溫后精密加入200μL含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸銨水溶液復(fù)溶，超聲30s，以5000 r/min離心，取上清液以0.22μm微孔濾膜濾至小插管內(nèi)，取續(xù)濾液測(cè)定。若檢樣中所測(cè)藥物化學(xué)成分濃度過高，可適當(dāng)以流動(dòng)相初始溶液稀釋至線性范圍內(nèi)，再行測(cè)定。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別以試劑空白、樣品基質(zhì)空白、試劑空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(加入濃度100ng/mL)、樣品基質(zhì)空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(加入濃度100ng/mL)，按2.4制備樣品，按2.1及2.2的分析條件得到氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分總離子流提取色譜圖及各成分定量離子對(duì)、定性離子對(duì)色譜圖。結(jié)果見圖1-2，試劑空白、樣品基質(zhì)空白均無干擾。

(I為試劑空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、II為全血空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、III為尿液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、IV為唾液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、V為試劑空白、VI為全血空白、VII為尿液空白、VIII為唾液空白)

圖1 總離子流提取色譜圖

2.6 定性確認(rèn) 采用保留時(shí)間與對(duì)照品相一致，且提取的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品相一致，判為檢出。氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分試劑空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與樣品基質(zhì)空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所得二級(jí)質(zhì)譜圖(加入濃度100 ng/mL)比較見圖3。

(I為試劑空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、II為全血空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、III為尿液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、IV為唾液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、A～I(xiàn)依次為氯氮卓～地西泮、1為定量離子對(duì)、2為定性離子對(duì))

圖2 各離子對(duì)提取色譜圖

2.7 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察 采用2.1項(xiàng)下的色譜條件，2.2項(xiàng)下的質(zhì)譜條件，以2.3項(xiàng)下的不同基質(zhì)工作標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣檢測(cè)。以檢測(cè)所得峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。以定性離子對(duì)和定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比均大于3時(shí)的濃度(ng/mL)為檢出限。以定性離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于3，定量離子對(duì)提取的質(zhì)譜圖信噪比大于10時(shí)的濃度(ng/mL)為定量限。以在一定濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)大于0.99，為線性范圍。

2.8 精密度試驗(yàn) 選用不同基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)品使用液，按2.4法分別制備濃度為1.0、5.0、50、100 ng/mL質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6份平行樣，以相應(yīng)線性擬合方程計(jì)算測(cè)得濃度并計(jì)算RSD(n=6)。以全血為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在2.89%～8.65%；以尿液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在2.02%～6.54%；以唾液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在2.22%～7.26%。方法精密度符合要求。

2.9 基質(zhì)效應(yīng) 選用6批不同來源的不同基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)品使用液，按2.4法分別制備濃度為2.0、180 ng/mL質(zhì)控樣品。同時(shí)以空白溶液(含0.1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨水溶液)制備濃度為2.0、180 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以基質(zhì)存在下的峰面積與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積比值，并計(jì)算批間響應(yīng)RSD(n=6)。以全血為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.78%～7.55%；以尿液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.49%～8.01%；以唾液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.64%～7.85%。

以相應(yīng)線性擬合方程計(jì)算質(zhì)控樣品濃度值及批間RSD(n=6)。以全血為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.82%～8.43%；以尿液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.24%～6.85%；以唾液為基質(zhì)，氯氮卓等9種苯二氮卓類藥物成分RSD值在1.55%～7.02%。

6批不同來源的不同基質(zhì)試驗(yàn)所得RSD值均不大于15%，符合要求。

2.10 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按2.3方法另配一混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。選用不同基質(zhì)，加入此標(biāo)準(zhǔn)品使用液，按2.4法分別制備濃度為1.0、2.0、100、150 ng/mL質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6份平行樣，以相應(yīng)線性擬合方程計(jì)算測(cè)得濃度并計(jì)算回收率。三種基質(zhì)中氯氮唑、咪達(dá)唑侖、硝西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、勞拉西泮、阿普唑侖、三唑侖、地西泮四水平加標(biāo)回收率均在86.0%～98.2%之間。

(I為試劑空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、II為全血空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、III為尿液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、IV為唾液空白加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、A～I(xiàn)依次為氯氮卓～地西泮)

圖3 二級(jí)質(zhì)譜圖比較

2.11 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選用不同基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)品使用液，按2.4法分別制備濃度為2.0、180 ng/mL質(zhì)控樣品，室溫放置，在0、1、2、4、8、12、24h分別進(jìn)樣，測(cè)定濃度，與標(biāo)示濃度比較，偏差均在±15%范圍之內(nèi)。室溫24h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.12 質(zhì)控樣品使用 選用不同基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)品使用液，按2.4法分別制備濃度為2.0、100、180 ng/mL質(zhì)控樣品，在樣品檢測(cè)中同時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)控樣的檢測(cè)結(jié)果(應(yīng)在標(biāo)示濃度±15%范圍之內(nèi))對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確證。

2.13 樣品測(cè)定結(jié)果 選擇了近2年9例住院患者樣本(經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))，處方用藥均為地西泮，因地西泮半衰期在0.5～1.5h左右，選擇給藥后1h采樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。

3 討論

本法取樣量小，僅200μL，以QuEChERS方式凈化，簡單快速，回收率高，重現(xiàn)性好。采用QuEChERS- UPLC-MRM-IDA-EPI模式，檢出限低，方法靈敏，能同時(shí)定量與定性確證。從監(jiān)測(cè)結(jié)果來看，有一定實(shí)用意義。

本法只考察了室溫下的穩(wěn)定性結(jié)果，樣品不宜保存，應(yīng)在當(dāng)天檢測(cè)完畢。

由于沒有合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，質(zhì)控樣品的確證顯得尤為重要。在樣品檢測(cè)的同時(shí)，必須同時(shí)測(cè)定質(zhì)控樣品，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

表3 線性關(guān)系及檢出限、定量限考察結(jié)果 ng/mL

表4 地西泮監(jiān)測(cè)結(jié)果 μg/mL

從文獻(xiàn)來看，苯二氮卓類藥物的檢測(cè)可應(yīng)用于反興奮劑檢測(cè)[6]，也可應(yīng)用于刑事檢測(cè)[8]，而應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)的資料相對(duì)較少。苯二氮卓類藥物藥代動(dòng)力學(xué)差異大，用藥個(gè)體差異化明顯，治療窗口窄，易致“毒”，非常有必要開展深入的臨床監(jiān)測(cè)工作。本法可應(yīng)用于全血、尿液、唾液等不同生物基質(zhì)樣本，適用范圍廣，可根據(jù)臨床監(jiān)測(cè)需要有針對(duì)性地選用，更好地貼近臨床實(shí)際工作的需求。

[1]嚴(yán)麗娟，張峰，吳敏，等. UPLC-ESI MS/MS法定動(dòng)物飼料中苯二氮卓類藥物[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2011，30(11)：1 301-1 305.

[2]向甲甲，劉曉華，徐剛. 苯二氮卓類藥物檢測(cè)方法[J].寧波化工，2014(1)：6-9.

[3]李賢良，嚴(yán)愛花，郗存顯，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)牛奶中20種苯二氮卓類藥物殘留[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2013，32(4)：42-47.

[4]嚴(yán)愛花，李賢良，郗存顯，等. 固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)豬肉中18種苯二氮卓類藥物殘留量[J].分析與檢測(cè)，2013，39(4)：173-179.

[5]嚴(yán)愛花，李賢良，郗存顯，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)中成藥及保健品中非法添加的22種苯二氮卓類藥物[J].分析化學(xué)研究報(bào)告，2013，41(4)：509-516.

[6]張建麗，王占良，張亦農(nóng). 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定尿樣中11種苯二氮卓類藥物及其代謝產(chǎn)物[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2014，33(4)：479-482.

[7]甘蓓，況慧娟，涂瑾. 磁固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛肉中4種苯二氮卓類藥物的殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015，6(9)：3 677-3 683.

[8]王朝紅，張琳，趙蒙，等. 超高效液相色譜-質(zhì)譜定量測(cè)定全血中的13種苯二氮卓類安眠鎮(zhèn)靜藥物[J].刑事技術(shù)，2016，41(1)：46-49.