大葉當(dāng)歸中阿魏酸的提取工藝優(yōu)化研究

★ 王艷

(新縣人民醫(yī)院 河南 新縣 465550)

大葉當(dāng)歸(A.megaphylla)是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的一種,藥用部位為根。廣泛分布在三峽庫區(qū)的巴東、巫溪、石柱和巫山等地。在當(dāng)?shù)孛耖g常用作當(dāng)歸的代用品。含有與正品當(dāng)歸相同的阿魏酸、藁本內(nèi)酯、揮發(fā)油等活性成分[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明,阿魏酸有抗心肌缺血、缺糖、缺氧，抗血栓,抑制血小板聚集等藥理作用[1-2]。阿魏酸的提取方法報道很多，傳統(tǒng)提取方法耗時較長、操作麻煩、提取效率低；微波輔助提取法、超臨界CO2萃取等提取法方法雖能縮短時間，但因設(shè)備成本較高，操作麻煩，在實際生產(chǎn)中應(yīng)用較少。近幾年來閃式提取在中藥有效成分提取方面潛力巨大，發(fā)展迅速，其主要特點是高效節(jié)能、操作簡便、節(jié)約時間、經(jīng)濟實用、提取溫度低，且適應(yīng)范圍廣，對有效成分的破壞小，響應(yīng)面設(shè)計閃式提取法阿魏酸的研究未見文獻報道。

1 儀器與試藥

LG16-W高速微量離心機(上海醫(yī)學(xué)醫(yī)用儀器廠)；Agilent 1100 系列高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；超純水器(無錫醫(yī)用儀器公司)；SB3200-超聲波提取器(上海能信超聲有限公司)；751型可見分光光度計 (上海棱光技術(shù)有限公司 )；大葉當(dāng)歸采自巫溪大寧河畔1500米高山上，由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定。阿魏酸(20100516)；甲醇、乙腈均為色譜純，其余所用試劑均為分析純。

2 響應(yīng)面分析閃式提取法

本研究選取影響閃式提取工藝的三個因素，即提取液乙醇濃度(A)，物料和提取液比(B)，提取時間(C)作為考察因素，每個因素設(shè)計為三個水平。

2.1 響應(yīng)面試驗各個因素水平的確定 本研究選取提取溶液濃度，提取時間及料液比三個因素對阿魏酸提取率進行考察，依次對單因素進行考察，以確定每個因素的水平。阿魏酸為一類極性較大的有機化合物，一般提取采用不同濃度的乙醇溶液，本研究采用80%，70%，60%,50%濃度的乙醇溶液，每個濃度平行6次試驗，依據(jù)阿魏酸的測定方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為70%時，阿魏酸含量較高，因此選擇60%，70%，80%作為乙醇濃度的三個水平。同理采用同樣的方法，確定料液比和提取時間的水平。

2.2 響應(yīng)面分析法因素的選取及方案分析[11]分別稱取當(dāng)歸樣品 100g,依據(jù) Box-Benhnken中心組合設(shè)計原理,同時考慮單因素試驗的結(jié)果 ,選取乙醇濃度、提取時間、料水比3個因素,自變量的低、 中、 高水平分別以- 1、0、 1 編碼 ,以阿魏酸提取率作為響應(yīng)值 (R)。采用DESIGN-EXPERT對實驗結(jié)果進行回歸分析。試驗因素與水平見表1,試驗方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 大葉當(dāng)歸提取工藝響應(yīng)面表及結(jié)果(%)

3 試驗結(jié)果分析

采用 DESIGN-EXPERT軟件對表 3中不同試驗條件下得到的阿魏酸收率進行響應(yīng)面回歸分析 ,得擬合方程:

R1 = 6.33667+0.21125A+0.505000B+0.76875C-0.027500AB+0.13000AC+0.047500BC -0.12083A2+0.041667B2-0.37583C2方差分析結(jié)果，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

由表3可知,在置信區(qū)間 95%,回歸方程線性相關(guān)系數(shù) R2= 0.9875，回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義 , 真實、可靠 ?？捎米鲗嶒烖c對實驗結(jié)果進行分析。方程各變異源方差分析表明 ,擬合方程的一次項B/C,即乙醇濃度和提取時間對阿魏酸的提取率有顯著影響，而A因素即料液比對阿魏酸的提取率無顯著影響。AB/AC/BC交互項和A2/B2/C2二次項無顯著性影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果作出曲面圖 ,見圖 1～3。利用DESIGN-EXPERT軟件 ,進行分析計算 ,得阿魏酸閃式提取工藝最佳條件為: 提取時間1.18min,料液比 9∶100，乙醇濃度70%,阿魏酸的理論得率為7.163。根據(jù)在實際工作中的需要和統(tǒng)計分析的結(jié)果，選取乙醇濃度為70%，提取時間1min,料液比1∶12為實際工作時的工藝參數(shù)。

4 驗證實驗

為驗證優(yōu)選工藝的可靠性和重現(xiàn)性，取大葉當(dāng)歸100 g，按最優(yōu)工藝進行閃式提取，平行操作3份，阿魏酸的收率均值為7.01，RSD為1.20%，表明該工藝可行且穩(wěn)定，具可重復(fù)性和操作性。見表4。

表4 驗證實驗結(jié)果

5 乙醇回流提取法

大葉當(dāng)歸在工業(yè)上廣泛采取加熱回流提取有效成分阿魏酸，根據(jù)文獻報道加熱回流提取大葉當(dāng)歸中阿魏酸的優(yōu)化工藝為乙醇體積濃度70%，12倍量乙醇，提取三次，每次2.5h。按此參數(shù)制備樣品3批，并按照“阿魏酸的含量測定”方法測定，計算平均結(jié)果與響應(yīng)面設(shè)計閃式提取的優(yōu)化結(jié)果進行對比，見表5。

圖1 R1=f1(B,C) 圖2 R1=f(A,B) 圖3 R1=f(A,C)

表5 響應(yīng)面設(shè)計閃式提取與加熱回流提取的比較 (%)

6 討論

該文采用響應(yīng)面分析法對阿魏酸提取工藝進行優(yōu)化 ,并得到回歸方程。其最佳閃式提取工藝條件為70%的乙醇，料液比1∶12，閃式提取1min。該方法操作方便、成本低廉、效率較高、提取時間短等特點。與傳統(tǒng)提取方法相比，閃式提取提取時間僅為乙醇加熱回流提取法的1/150，且閃式提取法阿魏酸含量較高。

響應(yīng)面分析法通過中心組合實驗研究幾種實驗因素間相互作用的一種回歸分析方法,和傳統(tǒng)方法相比具有實驗次數(shù)少，周期短和回歸方程精確度高等優(yōu)點,并能從圖形方面分析尋求最優(yōu)實驗考察因素[12-15]。該實驗利用響應(yīng)面分析法設(shè)計閃式提取法所得阿魏酸提取最佳工藝 ,具有重復(fù)性好、操作方便、提取效率高等優(yōu)點。

[1]黃偉暉,宋純青.當(dāng)歸的化學(xué)和藥理學(xué)研究進展[J].中國中藥雜志,2001,26(3):147-151+155.

[2]韋瑋,龔蘇曉,張鐵軍,等.當(dāng)歸多糖類成分及其藥理作用研究進展[J].藥物評價研究,2009,32(2):130-134.

[3]裴媛,譚初兵,徐為人,等.當(dāng)歸苯酞類和萜類成分作用的虛擬評價[J].中草藥,2010,41(6):938-941.

[4]嚴(yán)輝,段金廒,錢大瑋,等.我國不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材質(zhì)量的分析與評價[J].中草藥,2009,40(12):1 988-1 992.

[5]劉東輝,黃水清,黃月純,等.當(dāng)歸補血湯皂苷類成分HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材,2006,29(8):844-846.

[6]王慶敏,李曉寧,王兵,等.當(dāng)歸補血湯有效部位指紋圖譜歸屬分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(11):2 658-2 660.

[7]孫備,楊士友,裴月梅,等.清上蠲痛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2001,7(6):3-5.

[8]王婕,建邦,宋平順. 30批當(dāng)歸中阿魏酸、藁本內(nèi)酯含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(16)，70-72.

[9]唐力英,王祝舉,赫 炎,等.高效液相色譜法測定當(dāng)歸中阿魏酸的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2006,12(2):14-15.

[10]張慕群,孟召全,崔淑蓮.調(diào)經(jīng)止痛顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2010,16(4):62-63.

[11]徐鵬,錢竹,章克昌,等.響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝菌絲體胞內(nèi)靈芝酸的提取[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2007, 19: 104 - 108.

[12]孫振球.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社, 2002: 181 - 195.

[13]郭輝, 羅宇倩,章華偉,等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取荷葉黃酮工藝研究[J].中國食品科學(xué),2011,11(1):120-123.

[14]林維先.試驗設(shè)計方法[M].大連:大連海事出版社,1995.

[15]任露泉.試驗優(yōu)化與設(shè)計[M].北京:高等教育出版社,2003.