巴戟天對(duì)卵巢切除大鼠OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響*

★ 鄭德開 阮詩釩 葉春華 陳琳 陳睿 林海鳴

(福建中醫(yī)藥大學(xué) 福州 350122)

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是一種以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病，常見于老年人，特別是絕經(jīng)后的女性，極大威脅和影響著人們的生命健康和生活質(zhì)量。然而，因其調(diào)節(jié)機(jī)制以及病因病理的復(fù)雜性，目前仍無有效的藥物將其徹底治愈。隨著OPG-RANK-RANKL軸的發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥的研究取得了突破性的進(jìn)展[1]，并已經(jīng)成為藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。而巴戟天作為我國四大南藥之一,具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨的作用，是治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物[2]，而其作用機(jī)制卻仍未被闡明。本實(shí)驗(yàn)基于OPG-RANK-RANKL軸，通過觀察巴戟天對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠血清E2、OPG和RANKL的影響，探討巴戟天防治骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡雌性SD大鼠30只，SPF級(jí)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002，合格證編號(hào)：2015000517533。在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心鼠類實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施為SPF級(jí)(合格證號(hào):SYXK (閩)2014-0005)。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備 巴戟天顆粒劑(江陰天江藥業(yè)有限公司)，E2、OPG、RANKL酶聯(lián)免疫吸附測(cè)試試劑盒(上海西唐公司)，AIR TECH無菌操作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，移液槍(Thermo labsystems公司)，64R低溫高速離心機(jī)(美國Beckman公司)，Du650紫外分光光度計(jì)(美國Beckman公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 對(duì)30只3月齡雌性SD大鼠，按隨機(jī)分組原則分為假手術(shù)組、模型組、巴戟天高劑量、巴戟天中劑量組、巴戟天低劑量組，每組各6只，除假手術(shù)組外，其余24只手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，進(jìn)行骨質(zhì)疏松的造模。具體步驟如下:用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，手術(shù)部位剪毛消毒，取腹部正中切口約1.5cm，切開皮膚、皮下組織、腹膜，撥開腹腔內(nèi)脂肪，可見大鼠“Y”形子宮，沿子宮探及子宮末端左右雙側(cè)卵巢，行完全結(jié)扎切除術(shù)，逐層縫合，術(shù)后3天連續(xù)肌注青霉素預(yù)防感染；假手術(shù)組除未行卵巢結(jié)扎切除外，其余步驟與前同。

2.2 給藥方法 本實(shí)驗(yàn)采用灌胃給藥。巴戟天中劑量組用藥劑量相當(dāng)于臨床等效劑量(人和動(dòng)物體表面積折算等效劑量比率表)，即0.5g/100g(巴戟天顆粒/體重)溶于5mL蒸餾水灌注；巴戟天高劑量組用藥劑量相當(dāng)于臨床等效劑量兩倍，即1g/100g(巴戟天顆粒/體重)溶于5mL蒸餾水灌注；巴戟天低劑量組用藥劑量相當(dāng)于臨床等效劑量0.5倍，即0.25g/100g(巴戟天顆粒/體重)溶于5mL蒸餾水灌注；假手術(shù)組用等量(5mL)生理鹽水灌注。

2.3 取材與檢測(cè) 連續(xù)灌胃12周后，處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清E2、OPG以及RANKL含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組之間血清E2水平比較 假手術(shù)組血清E2水平較模型組升高(P<0.01),巴戟天治療組各組E2水平隨著劑量的增高而逐漸增高，其中巴戟天高劑量組血清E2水平較模型組升高(P<0.01),巴戟天中劑量組E2水平較模型組升高(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 各組之間血清OPG,RANKL水平比較 假手術(shù)組血清OPG水平較模型組高(P<0.01)、RANKL水平較模型組低(P<0.01)。巴戟天高劑量組血清OPG水平與模型組相比升高(P<0.01)，而RANKL水平降低(P<0.01)巴戟天中劑量組血清OPG水平較模型組升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清E2、OPG、RANKL含量

注:與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)，是一種高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥，是婦女更年期階段最常見的骨代謝性疾病。研究表明，更年期女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松最主要的原因之一是由于雌激素的缺乏，造成骨吸收和骨形成的平衡失調(diào)[3]。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在切除卵巢后，假手術(shù)組雌激素水平顯著高于模型組，巴戟天各劑量組雌激素水平均較模型組則升高,其中巴戟天高、中劑量組與模型組相比雌激素水平升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。顯示巴戟天可能具有雌激素樣作用，與之前一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[4]。

隨著OPG-RANK-RANKL軸的發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松的研究取得了突破性的進(jìn)展[5]。目前已有多項(xiàng)研究表明，該軸對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，與骨代謝密切相關(guān)，并且可能是大多數(shù)激素與細(xì)胞因子發(fā)揮作用的最后通路[6]。雌激素可通過與成骨細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，促進(jìn)OPG的基因表達(dá)和蛋白合成[7]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，巴戟天各劑量組OPG均較模型組高。其中巴戟天中、高劑量組與模型組相比,其血清OPG變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而巴戟天各劑量組RANKL均較模型組低，其中巴戟天高劑量組較模型組顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)顯示，巴戟天高劑量組能夠提高血清OPG的水平，降低RANKL的水平，推測(cè)其對(duì)于成骨細(xì)胞分泌OPG有促進(jìn)作用，但血清OPG水平易受多種因素影響，故仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，巴戟天能夠使骨質(zhì)疏松大鼠血清雌激素水平升高，使OPG水平增高、RANKL水平降低。推測(cè)巴戟天具有類雌激素作用，能提高雌激素水平，通過影響OPG/RANK/RANKL軸，使成骨細(xì)胞OPG的合成和分泌增加，與RANKL競(jìng)爭性結(jié)合,抑制RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的功能活性，抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成，起到防治骨質(zhì)疏松的作用。但本實(shí)驗(yàn)主要采用血清學(xué)指標(biāo)，易受多種因素的綜合影響，故有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

[1]孔祥鶴,牛銀波,李宇華,等.OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)與骨質(zhì)疏松研究最新進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2011;15(1):80-85.

[2]何劍全,陳健.巴戟天抗骨質(zhì)疏松癥作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,5(6):546-548.

[3]Kousteni S,Chen JR,Bellido T,et al.Reversal of bone loss in mice by nongenotropic signaling of sex steroids[J].Science,2002,298(5594):843-846.

[4]王寅,張巧艷.巴戟天雌激素樣作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(3):527-528.

[5]Lozo P,Krpan D,Krvavica A,et a1.Bone histology in postmenopausal osteoporosis-variations in cellular activity[J].Aet Med Croatica,2004.58(1):5-11.

[6]鄒世恩,張紹芬.細(xì)胞因子在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中的作用[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2012,18(4):375-380.

[7]Mone Z,Baljit SM,Li S,et a1.Understanding osteoclast formation and function:Implications for future Therapies for osteoporosis[J].Curr OpinOrthop,2003,14(5):341-350.