斯氏副柔線蟲半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因的克隆及原核表達(dá)

王文龍，馮陳晨，王金玲，呼和巴特爾，劉春霞

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

斯氏副柔線蟲病是由斯氏副柔線蟲(Parabronemaskrjabini)寄生于駱駝、牛、羊等反芻動物真胃引起的一種寄生蟲病,尤以駱駝感染較為嚴(yán)重[1-3]。大量蟲體寄生可導(dǎo)致患畜真胃發(fā)生炎癥、出血及潰瘍,嚴(yán)重者造成駱駝死亡,對養(yǎng)駝業(yè)危害極大，是危害我國養(yǎng)駝業(yè)的一種主要寄生蟲病，給農(nóng)牧民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對斯氏副柔線蟲病的監(jiān)測和診斷是駱駝寄生蟲病防控中的重點(diǎn)。

由于駱駝多分布在第三世界國家的落后地區(qū)，所以時至今日，國內(nèi)外關(guān)于斯氏副柔線蟲病的研究相對滯后，主要是關(guān)于分類和傳播媒介的研究[4-6]。在駱駝斯氏副柔線蟲病的防控上，目前存在的主要問題是缺少針對該病的系統(tǒng)的基礎(chǔ)理論研究、缺乏有效的生前診斷方法和防治的新方法。適用于許多寄生性線蟲的糞便蟲卵檢查法可用于該病的診斷，但檢出率非常低，很難用于臨床實(shí)踐。該病的診斷主要依靠死后剖檢(在真胃查找蟲體)，此類診斷方法不能為早期治療提供參考。在實(shí)際生產(chǎn)中，往往是在沒有診斷依據(jù)的情況下盲目地給藥驅(qū)蟲，造成經(jīng)濟(jì)損失的同時也帶來了諸如毒副作用、出現(xiàn)耐藥蟲株及畜產(chǎn)品獸藥殘留超標(biāo)等諸多弊端。

因此，本研究在斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序分析的基礎(chǔ)上[7]，篩選出了半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因作為候選抗原基因，對其進(jìn)行功能注釋，生物信息學(xué)分析，并對該基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和抗原性驗(yàn)證。研究結(jié)果可為該病的血清學(xué)診斷方法和免疫防控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體、血清、質(zhì)粒與菌株 斯氏副柔線蟲采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特后旗駱駝體內(nèi)，液氮中保存；斯氏副柔線蟲病駱駝陽性血清、陰性血清均采自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特后旗；pMD19-T simple vector，Takara公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pET30a(+)，Invitrogen公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α、BL21(DE3)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要的酶和試劑 總RNA提取試劑RNAiso Plus、Primer ScriptTM RT reagent Kit、DNA A-Tailing Kit，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，AXYGEN公司產(chǎn)品；BCA Protein assay kit、Ni-NTA SefinoseTMResin Kit、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Prime STAR?GXL DNA Polymerase、DNA T4連接酶，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光(ECL)底物顯影液，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗駱駝IgG，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司制備。

1.2 方法

1.2.1 Pj-CPR基因生物信息學(xué)分析 利用生物信息學(xué)軟件對斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序得到的Pj-CPR基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)和ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/)軟件預(yù)測開放閱讀框，SignalIP4.1 server(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)在線軟件進(jìn)行信號肽序列預(yù)測；SecretomeP.2.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/Secret omeP/)軟件進(jìn)行非典型蛋白分泌物預(yù)測；TMHMM server.v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/)軟件進(jìn)行跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域分析；TargetP 1.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services /TargetP/)軟件預(yù)測真核生物蛋白亞細(xì)胞定位；BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/BepiPred/)軟件進(jìn)行抗原表位預(yù)測。

1.2.2 Pj-CPR基因的擴(kuò)增及克隆測序 根據(jù)斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組測序中半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列設(shè)計(jì)1對引物并分別在上游引物和下游引物中引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)。上游引物：5′-CGGAATTCATGAAACGTTCCCTCCTC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTTCATATGTTTCTTCACC-3′，引物由華大基因有限公司合成。

參照RNAiso Plus說明書提取斯氏副柔線蟲總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Primer ScriptTMRT reagent Kit)合成cDNA，再以RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；最后72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pMD19-T simple vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，PCR及EcoRⅠ/XhoⅠ質(zhì)粒雙酶切鑒定為陽性的菌株由華大基因公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 從測序結(jié)果正確的菌株中提取克隆質(zhì)粒(命名為pMD-CPR)，將pMD-CPR和表達(dá)載體pET30a(+)分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切后，以凝膠回收試劑盒回收目的基因和載體片段，用T4 DNA連接酶連接構(gòu)建Pj-CPR基因原核表達(dá)載體(命名為pETCPR)并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。在含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，挑取單菌落分別進(jìn)行質(zhì)粒電泳、PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，陽性菌株送華大基因公司進(jìn)行序列測定。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 重組表達(dá)菌BL21(pETCPR)用1.0 mol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)超聲波裂解菌體，離心收集超聲上清和超聲沉淀，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)形式。

采用不同誘導(dǎo)劑濃度、不同時間及不同溫度誘導(dǎo)重組表達(dá)菌，SDS-PAGE電泳分析，確定最佳誘導(dǎo)條件。Pj-CPR基因重組表達(dá)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體，以溶菌酶和超聲波法裂解菌體，離心收集包涵體沉淀，用8 mol/L尿素溶解，再離心收集上清液，以0.45 μm孔徑濾器過濾后，按照上海生工Ni-NTA SefinoseTMResin Kit步驟純化重組蛋白。

1.2.5 重組蛋白的Western blot檢測 重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的封閉液于室溫封閉3 h；以駱駝斯氏副柔線蟲病陽性血清(1∶1 000)為一抗，同時設(shè)陰性血清對照；以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗駱駝IgG為二抗(1∶5 000)，用ECL超敏顯影液顯色進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié)果

2.1 Pj-CPR基因生物信息學(xué)分析

通過ExPASy和ORFfinder在線軟件對Pj-CPR基因進(jìn)行特征性分析，結(jié)果顯示，Pj-CPR基因核酸序列長度為291 bp，蛋白分子質(zhì)量為11.93 ku，含有一個編碼97個氨基酸的完整ORF，其中有強(qiáng)酸氨基酸14個，強(qiáng)堿氨基酸14個，疏水氨基酸26個和極性氨基酸34個，等電點(diǎn)為7.304。

用SignalP和SecretomeP軟件對基因編碼蛋白的信號肽序列進(jìn)行預(yù)測和非典型分泌蛋白分析，結(jié)果Pj-CPR存在信號肽序列，且SecretomeP軟件預(yù)測中NN-Score=0.860，屬于分泌蛋白(圖1)。用BepiPred軟件預(yù)測基因編碼蛋白抗原表位，結(jié)果表明，Pj-CPR蛋白存在5個抗原表位，分別為STGNTNELE(aa 20-28)、LG(aa 39-40)、EQLR(aa 42-45)、QYSKPDADANL(aa 57-67)、ERYKRGEETYE(aa 87-97)，表明Pj-CPR編碼的分泌性蛋白具有較好抗原性。

圖1 Pj-CPR基因信號肽序列分析Fig.1 The analysis of signal peptide sequence of Pj-CPR gene

用TMHMM和TargetP軟件對基因進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)預(yù)測和蛋白亞細(xì)胞定位分析，并分析跨膜蛋白中氨基酸在胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的數(shù)量。結(jié)果顯示，Pj-CPR不是跨膜蛋白，且整個蛋白均位于胞外(圖2)；在TargetP軟件預(yù)測中由于信號肽的存在，該蛋白也被定位到分泌途徑中。

圖2 Pj-CPR蛋白跨膜區(qū)分析Fig.2 The analysis of Pj-CPR transmembarne domain

2.2 目的基因的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

以斯氏副柔線蟲RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用特異性引物對Pj-CPR基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，獲得了約291 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相符(圖3)。經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組表達(dá)菌，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，得到了約291 bp的片段，表明Pj-CPR基因已插入到表達(dá)載體pET30a(+)上(圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1、2.Pj-CPR基因；3.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1，2.RT-PCR products of Pj-CPR gene; 3.Negative control

圖3 Pj-CPR基因RT-PCR產(chǎn)物電泳

Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR products of Pj-CPR gene

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～3.pETCPR載體 M.DNA Marker DL 2 000；1-3.pETCPR vector圖4 表達(dá)載體pETCPR酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Enzyme digestion results of pETCPR

2.3 序列分析

將斯氏副柔線蟲Pj-CPR基因克隆載體和表達(dá)載體測序結(jié)果同轉(zhuǎn)錄組測序基因序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Pj-CPR基因序列與轉(zhuǎn)錄組測序的序列完全一致，說明成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體。

2.4 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)菌BL21(pETCPR)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳檢測，與BL21(DE3)空菌和空載體轉(zhuǎn)化菌BL21(pET30)相比，出現(xiàn)了特異性目的基因融合蛋白表達(dá)帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖5)。分析其超聲上清和超聲沉淀，目的蛋白絕大部分在沉淀中，表明目的蛋白主要是以包涵體的形式表達(dá)(圖6)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.BL21(DE3)空菌; 2.BL21(pET30)誘導(dǎo)前; 3.BL21(pET30)誘導(dǎo)后; 4～6.BL21(pETCPR)在25℃、30℃和37℃下誘導(dǎo)表達(dá)

M.Protein molecular weight Marker; 1.BL21(DE3)；2.Before induced BL21(pET30)；3.After induced BL21(pET30);4-6.BL21(pETCPR) induced at 25℃,30℃ and 37℃ respectively

圖5重組菌誘導(dǎo)表達(dá)電泳結(jié)果

Fig.5 Electrophoresis of expression products of recombinant bacteria

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. BL21(pETCPR)裂解上清; 2. BL21(pETCPR)裂解沉淀

M.Protein molecular weight Marker; 1.Supernatant of the lysate of BL21(pETCPR)；2.Pellets of the lysate of BL21(pETCPR)

圖6 rCPR表達(dá)形式的電泳結(jié)果

Fig.6 SDS-PAGE analysis of rCPR expression inE.coli

2.5 重組蛋白Western blot分析

重組Pj-CPR蛋白(簡稱rCPR)Western blot結(jié)果表明，重組蛋白rCPR與陽性血清在17.6 ku處出現(xiàn)了特異性顯色帶，陰性血清對照在相應(yīng)位置無顯色條帶(圖7)。說明rCPR能夠與斯氏副柔線蟲感染駱駝血清中的IgG特異性結(jié)合，具有較好的免疫活性。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.陽性血清；3.陰性血清

M.Protein molecular weight Marker；1，2.Positive serum;3.Negative serum

圖7 rCPR Western blot檢測結(jié)果

Fig.7 Western blot analysis of the rCPR

3 討論

高通量測序分析技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種高效的研究手段，促進(jìn)了生物學(xué)研究領(lǐng)域的快速發(fā)展[8]。在寄生蟲的研究上，也得到了廣泛的應(yīng)用[9-10]，寄生蟲的一些分泌性蛋白同源物，如氨肽酶類、蛋白酶類及毒性分泌物等，被認(rèn)為是與寄生蟲免疫相關(guān)的抗原蛋白，具有免疫原性，在寄生蟲免疫調(diào)節(jié)、免疫逃避及寄生蟲與宿主互作中起關(guān)鍵作用[11-14]。這些功能性抗原可以為篩選疫苗抗原、發(fā)掘藥物靶點(diǎn)及確定診斷抗原提供依據(jù)[15-16]。目前，國內(nèi)外未見關(guān)于斯氏副柔線蟲病免疫學(xué)診斷和免疫防控的研究報(bào)道。本研究所選的半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因是在斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他相關(guān)線蟲的免疫學(xué)候選基因研究，篩選出的一種免疫候選基因[17]。生物信息學(xué)分析表明，斯氏副柔線蟲Pj-CPR基因編碼產(chǎn)物注釋功能為半胱氨酸蛋白酶，是一種具有信號肽序列的分泌蛋白。蛋白跨膜區(qū)預(yù)測和蛋白亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白屬非跨膜蛋白，主要位于胞外；抗原表位預(yù)測有5個抗原表位，具有較好的抗原性。通過生物信息學(xué)分析，斯氏副柔線蟲Pj-CPR基因符合寄生蟲免疫學(xué)診斷和免疫防控候選基因的特點(diǎn)。

本研究從斯氏副柔線蟲中克隆了Pj-CPR基因并構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體，測序結(jié)果表明克隆的基因與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)載體。原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)后，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，與BL21(DE3)空菌和含有pET30a(+)空載體的BL21(pET30a)相比，獲得了預(yù)期大小的重組蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果證實(shí)了重組Pj-CPR蛋白能夠與感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清中的抗體特異性結(jié)合，而與未感染斯氏副柔線蟲的駱駝血清不發(fā)生反應(yīng)，說明所獲得的重組蛋白為斯氏副柔線蟲Pj-CPR基因重組蛋白，該基因編碼產(chǎn)物，在自然感過程中能夠刺激宿主產(chǎn)生特異性抗體。由于該基因在GenBank中與常見反芻動物寄生蟲基因比較為該病原特有基因，是一種具有重要生物功能的蛋白酶，所以該基因可以作為斯氏副柔線蟲的免疫學(xué)診斷和防控的候選基因。研究結(jié)果可為家畜，特別是駱駝斯氏副柔線蟲相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊蓮茹,楊曉野,劉珍蓮,等.內(nèi)蒙古地區(qū)駱駝斯氏副柔線蟲(Parabronemaskrjabini)病調(diào)查[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2004,25(1):43-45.

[2] Seyed S H.Molecular characterization of the first internal transcribed spacer of rDNA ofParabronemaskrjabinifor the first time in sheep[J].Ann Parasitol,2015,61(4):241-246.

[3] Hasheminasab S S,Jalousian F,Meshgi B.Molecular and morphological characterization ofParabronemaskrjabiniof sheep and goats at three different geographical zones in Iran[J].Ann Parasitol,2016,62(1):55-61.

[4] Hasheminasab S S. 5.8 S rRNA sequence and secondary structure inParabronemaskrjabiniand related habronematidae species[J].Iran J Parasitol,2016,11(2):253-258.

[5] 陳林軍，史紅蕾，楊蓮茹，等.角蠅各齡期幼蟲體內(nèi)斯氏副柔線蟲的分子生物學(xué)鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2016,52(2):15-21.

[6] 鄧 僑，楊蓮茹，楊曉野，等.駱駝斯氏副柔線蟲病傳播媒介西方角蠅和截脈角蠅的幼蟲齡期劃分[J].昆蟲學(xué)報(bào),2015，58(3):341-350.

[7] 馮陳晨，王文龍，呼和巴特爾.駱駝斯氏副柔線蟲轉(zhuǎn)錄組的高通量測序及分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017,37(4)：671-675.

[8] Blazie S M,Babb C,Wilky H,et al.Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation inCaenorhabditiselegansintestine and muscles[J].BMC Biol,2015,13:4.doi: 10.1186/s12915-015-0116-6.

[9] Liu G H,Xu M J,Chang Q C,et al.De novo transcriptomic analysis of the female and male adults of the blood flukeSchistosomaturkestanicum[J].Parasites & Vectors,2016,9:143.

[10] 巨 艷,李子華,王婭娜,等.細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴mRNA測序及表達(dá)譜分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2015,31(1):21-25.

[11] 曹曉丹.日本血吸蟲排泄分泌蛋白的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2016.

[12] Tritten L,Clarke D,Timmins S,et al.Dirofilariaimmitisexhibits sex-and stage-specific differences in excretory/secretory miRNA and protein profiles[J].Vet Parasitol,2016,232:1-7.

[13] Eberle R,Brattig N W,Trusch M,et al.Isolation,identification and functional profile of excretory-secretory peptides fromOnchocercaochengi[J].Acta Trop,2015,142:156-66.

[14] Djafsia B,Ndjonka D,Dikti J V,et al.Immune recognition of excretory and secretory products of the filarial nematodeOnchocercaochengiin cattle and human sera[J].J Helminthol,2015,11:1-9.

[15] Cao X,Fu Z,Zhang M,et al.iTRAQ-based comparative proteomic analysis of excretory-secretory proteins of schistosomula and adult worms ofSchistosomajaponicum[J].J Proteomics,2016,138:30-39.

[16] Cao X,Fu Z,Zhang M,et al.Excretory/secretory proteome of 14-day schistosomula,Schistosomajaponicum[J].J Proteomics,2016,130:221-230.

[17] 李孝軍.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲分泌排泄抗原基因的研究[D].浙江杭州：浙江大學(xué)，2005.