SLC12A5和Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

王曉元，趙軼峰，楊永江，武雪亮，李 坤，李曙光

盡管近年來結(jié)直腸癌的普查力度不斷加強(qiáng)、手術(shù)方式不斷改進(jìn)、靶向藥物的大力推廣，并取得了一系列的突破，但其術(shù)后5年生存率仍不到50%[1]，因而深入探尋結(jié)直腸癌的分子機(jī)制和特異性強(qiáng)的標(biāo)志物，對(duì)于早期診斷、臨床治療、術(shù)后監(jiān)測(cè)有著極其重要的價(jià)值。

SLC12A5是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型致癌基因，該基因能顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖和促進(jìn)G1-S期轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。目前僅在膀胱移行細(xì)胞癌中顯示SLC12A5呈高表達(dá)狀態(tài)，SLC12A5在癲癇等一些神經(jīng)功能疾病中發(fā)揮重要作用[3-4]，而在結(jié)直腸癌方面的研究鮮有報(bào)道。Ki-67是目前應(yīng)用較廣的腫瘤增殖性抗原，其表達(dá)指數(shù)常用于評(píng)估惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活性[5]。該研究通過免疫組化法檢測(cè)SLC12A5和Ki-67表達(dá)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，探討其相互關(guān)系及與相關(guān)臨床病理因素間的相關(guān)性，為結(jié)直腸癌的診斷、靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年9月～2017年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸腫瘤外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織40例、結(jié)直腸腺瘤30例和正常結(jié)直腸組織40例，癌組織取自癌灶中心處，另取標(biāo)本殘端切緣經(jīng)病理證實(shí)為正常腸組織。全部病例為原發(fā)性腫瘤，且術(shù)前未行新輔助放化療等針對(duì)性治療，術(shù)后標(biāo)本均在1 h內(nèi)獲得，并存于液氮中。其中結(jié)直腸癌組織中男25例，女15例, 年齡32～70(50.5±14.6)歲；腺瘤組織中，男19例，女11例,年齡30～66(51.3±11.8)歲，正常結(jié)直腸組織中, 男22例，女18例,年齡31～68(51.6±11.5)歲，3組一般資料具有可比性。

1.2主要試劑與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑 兔抗人單克隆濃縮型SLC12A5抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體購(gòu)自香港Abcam公司；DAB顯色劑購(gòu)自上海Gene Tech公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 10%甲醛溶液固定標(biāo)本，石蠟包埋，切片4 μm，蘇木精-伊紅染色，病理診斷。切片經(jīng)80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù)；PBS洗3次，加一抗(1 ∶100)50 μl，4 ℃過夜；PBS洗3次，加二抗50 μl。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明，樹膠封片，陰性對(duì)照為PBS代替一抗，光鏡下觀察。

1.2.3陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) SLC12A5陽性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)于細(xì)胞核，Ki-67陽性染色主要集中于細(xì)胞核，均為棕黃色或褐色顆粒，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比并評(píng)分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%時(shí)為2分，51%～75%時(shí)為3分，>75%時(shí)為4分；無著色:0分，淺黃色:1分，黃色:2分，深黃色:3分。兩者相乘，0分為(-) ,1～4分為(+) ,5～8分為(),9～12分為(),(+)～()均視為陽性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)分析SLC12A5和Ki-67的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，相關(guān)性分析采用Pearson法，設(shè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌、腺瘤、正常組織中SLC12A5和Ki-67表達(dá)情況癌組、腺瘤組和正常組織中SLC12A5陽性表達(dá)率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌組、腺瘤組和正常組織中Ki-67陽性表達(dá)率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表1、2。

2.2SLC12A5和Ki-67表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系SLC12A5和Ki-67的表達(dá)均與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)相關(guān)(P<0.05)。TNM分期高、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)的患者SLC12A5和Ki-67的表達(dá)均增強(qiáng)，而SLC12A5和Ki-67的陽性表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等均無相關(guān)性,見表3。

2.3SLC12A5和Ki-67在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相互關(guān)系SLC12A5和Ki-67在結(jié)直腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.518,P=0.000)。SLC12A5在Ki-67陽性組中的表達(dá)(陽性率82.05%)明顯高于在Ki-67陰性組中的表達(dá)(陽性率36.36%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表4。

圖1 結(jié)直腸正常組織、腺瘤和癌組織中SLC12A5、Ki-67蛋白的表達(dá) SP×200

組別nSLC12A5(n)-+陽性率(%)χ2值P值癌4056111887．5016．3860．000腺瘤301665346．677．957?#0．008正常402773332．504．525?0．032

與癌組比較：*P<0.05;與正常組比較：#P<0.05

表2 Ki-67在結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

與癌組比較：*P<0.05;與正常組比較：#P<0.05

表3 SLC12A5、Ki-67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系

表4 SLC12A5、Ki-67在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(n)

3 討論

SLC12A5是溶質(zhì)載體家族12亞組中的重要成員之一，定位于人染色體20q13.12，這是人類多種惡性腫瘤最常見的擴(kuò)增區(qū)[6]。SLC12A5最初是作為一種跨膜氯化鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體被發(fā)現(xiàn)的，這種轉(zhuǎn)運(yùn)體可以維持神經(jīng)元內(nèi)外氯平衡，因而最初對(duì)SLC12A5的研究?jī)H局限于癲癇、精神分裂癥、情感障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7-8]。而近年來研究[9]顯示SLC12A5突變或異常表達(dá)參與某些實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[10]表明，SLC12A5抗凋亡的作用是通過抑制凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G-依賴的凋亡信號(hào)通路介導(dǎo)的，而促轉(zhuǎn)移作用是通過調(diào)節(jié)基質(zhì)體系結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵要素，包括各類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和纖維連接蛋白(FN類)等。

Ki-67是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)志物之一，與多種腫瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān),其在細(xì)胞周期的G1、Gs、G2和M期均有表達(dá)，是全面準(zhǔn)確評(píng)估增殖活性的客觀指標(biāo)[11-12]。

本研究通過免疫組化法檢測(cè)顯示SLC12A5在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織，表明SLC12A5過表達(dá)在結(jié)直腸癌癌變過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，SLC12A5是一種促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展的致癌基因。結(jié)直腸癌伴漿膜浸潤(rùn)者較未侵及漿膜者SLC12A5蛋白表達(dá)明顯增高；伴肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)者較無轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)者SLC12A5蛋白表達(dá)明顯增高；TNM分期越高，SLC12A5蛋白表達(dá)也越高，表明SLC12A5蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，對(duì)結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。Yu et al[13]通過單細(xì)胞測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)突變型SLC12A5在大腸癌患者中呈高表達(dá)，而在正常人群中呈低表達(dá)，因而表明突變型SLC12A5在大腸癌中有潛在的致癌作用。進(jìn)一步研究顯示SLC12A5的過表達(dá)與大腸癌患者生存期顯著下降關(guān)系密切。Xu et al[14]通過基因測(cè)序、基因擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn)SLC12A5與原發(fā)性大腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，其能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1過渡，增強(qiáng)其侵襲、遷移能力。Liu et al[15]通過實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)癌細(xì)胞系、Western blot法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SLC12A5在膀胱腫瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLC12A5可能作為調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)膀胱腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，本研究顯示SLC12A5和Ki-67二者在結(jié)直腸癌中呈明顯正相關(guān)性，二者在結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展過程中具有協(xié)同作用，但具體機(jī)制目前尚不明確。

總之，SLC12A5的異常高表達(dá)參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、演進(jìn)，其誘導(dǎo)Ki-67的過表達(dá)可能是促進(jìn)其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，對(duì)二者作用機(jī)制的深入探討將有望為結(jié)直腸癌精準(zhǔn)化治療提供科學(xué)依據(jù)。

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