慢性牙周炎中齦溝液的S100A12 和MMP-8濃度變化及兩者關系探究

秦紅霞，柯雅莉，郭春杰，王 鵬

目前通過對人類齦溝液(gingival crevicular fluid，GCF)中生化因子的檢測來研究牙周病的報道越來越多，其能特異性的反映局部位點牙周組織的活動狀態(tài),存在大量牙周檢測指標[1]。基質金屬酶-8(matrix metalloproteinase-8，MMP-8)是慢性牙周炎的重要標記物[2]，主要由中性多形核粒細(polymorphonuclear neutrophils，PMN)分泌，破壞膠原纖維，促進骨吸收[ 3]。鈣結合蛋白是一個約36 ku蛋白[4]，主要存在于胞質蛋白中，屬于S100蛋白家族[5]。鈣結合蛋白S100A12(S100 calcium binding protein A12，S100A12)，是鈣結合蛋白S100多基因家族中的一員，由PMN分泌。S100A12是1995年首次在人體中發(fā)現(xiàn)的[6]，目前為止，關于S100A12與慢性牙周炎的相關研究仍很少。該實驗通過檢測S100A12和MMP-8在不同程度牙周炎齦溝液中的濃度，來探討S100A12作為評價牙周疾病的生化指標的可行性以及S100A12與MMP-8的相關性。

1 材料與方法

1.1材料0.5 ml EP管(河南天馳生物有限公司)；30號吸潮紙尖(美國登士柏公司)；200 μl加樣槍頭和移液器(美國吉爾森公司)；全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司)；37 ℃恒溫水浴箱(XMTD-204，余姚興泰儀表有限公司)；高速臺式離心機(德國艾本德公司)；牙周探針(德國INGUN公司)；-80 ℃冰箱(MDF-U53V，日本三洋電器有限公司)；電子天平(北京賽多斯科學儀器有限公司)；人MMP-8 ELISA檢測試劑盒和人S100A12 ELISA檢測試劑盒(上海紀寧生物科技有限公司)。

1.2收集樣本隨機選取2016年12月～2017年5月就診于鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔科的慢性輕度、中度和重度牙周炎患者各20例，年齡(41.85±7.77)歲，男女比例均衡。從醫(yī)院職工中隨機選取牙周組織健康者20例，年齡(30.25±4.19)歲，男女比例均衡。選擇每個受試者的第一或第二磨牙的近中頰側位點收集GCF(若是牙周炎患者，則從中選炎癥最重的一顆牙的近中頰側位點收集)。納入標準：① 無吸煙史或已戒煙1年；② 3個月內(nèi)未使用過抗生素類藥物、非甾體類抗炎藥；③ 6個月內(nèi)無牙周治療史且無正畸治療史；④ 慢性輕度牙周炎患者探診深度(probing depth，PD)≤4 mm，附著喪失(attachment loss, AL)1～2 mm，牙槽骨吸收≤1/3；慢性中度牙周炎患者PD≤6 mm，AL 3～4 mm，牙槽骨吸收≤1/2；慢性重度牙周炎患者PD>6 mm，AL≥5 mm，牙槽骨吸收>1/2；牙周健康者牙齦色形質正常，探診很少出血，無附著喪失和牙槽骨吸收。排除標準：① 患有全身系統(tǒng)性疾病，如高血壓、糖尿病等；② 長期用藥史如口服阿司匹林、激素類、免疫抑制劑等；③ 妊娠期或哺乳期的婦女；④ 侵襲性牙周炎患者；⑤ 受檢牙牙頸部有齲或充填體、修復體。

1.3齦溝液的收集先準備吸潮紙尖：將30號的吸潮紙尖尖端剪去3～5 mm,兩根紙尖同時放入一個EP管中，高溫高壓消毒、烘干后備用。然后收集齦溝液：去除齦上的菌斑和牙結石，吹干牙面，棉卷隔濕，將紙尖輕輕放入袋內(nèi)，遇到阻力時停止，靜置30 s，取出(有血液或唾液污染的丟棄)。30 s后用同樣的方法將第二根紙尖插入，放置30 s，取出。最后稱重：將盛有取樣后紙尖的EP管于電子天平上稱重，減去原重量即為采集到的GCF重量，稱重后將樣本立即放入-80 ℃冰箱中凍存。

1.4牙周檢查記錄受試牙的出血指數(shù)(bleeding index,BI)、PD、AL。BI是Mazza在1981年采用的改良出血指數(shù)，分6個等級。PD與AL均以mm為單位，四舍五入取整數(shù)。臨床指標的檢測應在取完齦溝液樣本后進行，防止探診出血，污染齦溝液。

1.5齦溝液的提取將凍存樣本在室溫下解凍20 min，加入200 μl PBS緩沖液，用高速臺式離心機5 000 r/min離心15 min，之后將吸潮紙尖丟棄。

1.6齦溝液中S100A12和MMP-8的濃度按照ELISA試劑盒說明操作，得出光密度(optical density,OD)值，計算標準曲線的直線回歸方程，將OD值帶入方程求得被稀釋后的樣本濃度。根據(jù)稀釋倍數(shù)(稀釋100倍)，計算出齦溝液中MMP-8以及S100A12的實際濃度。

2 結果

2.1各組受試者的基本情況和各檢測指標的結果每組受試者男女比例均衡(P=0.940)，但健康對照組中受試者平均年齡與其他3組比較偏低(P<0.05)。慢性牙周炎組的各項臨床檢測指標均明顯高于健康對照組(P<0.001)，見表1、2。

2.2齦溝液中S100A12和MMP-8水平的比較運用Kruskal-Wallis檢驗分析，得出P<0.001, 認為總體有差別。4組間MMP-8和S100A12濃度進行兩兩比較，結果：健康對照組與輕度慢性牙周炎組比較，差異無統(tǒng)計學意義，其余各組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3、圖1、圖2。

2.3S100A12和MMP-8水平及各臨床指標相關性分析總的樣本量都大于50，認為總體服從正態(tài)分布，所以相關性比較用Pearson積矩相關分析。齦溝液中MMP-8與S100A12的水平呈正相關性(P<0.001)，相關性較強(r=0.832)。同時，齦溝液中MMP-8的水平與GCF的量、GI、AL、PD呈正相關性(r=0.825、0.780、0.742、0.775，P<0.001)，S100A12的水平與GCF的量、GI、AL、PD也呈正相關性(r=0.895、0.821、0.776、0.851，P<0.001)。

表2 實驗組各指標檢測結果±s)

表3 總體及四組間MMP-8和S100A12水平的比較結果(P值)

1、2、3、4組分別代表健康對照組，輕度、中度、重度慢性牙周炎組

圖1 各組齦溝液中MMP-8水平的比較

與健康對照組比較：*P<0.05；與慢性輕度牙周炎組比較：#P<0.05;與慢性中毒牙周炎組比較：△P<0.05

圖2 各組齦溝液中S100A12水平的比較

與健康對照組比較：*P<0.05；與慢性輕度牙周炎組比較：#P<0.05；與慢性中毒牙周炎組比較：△P<0.05

3 討論

S100A12主要由PMN分泌，參與了早期炎癥的體內(nèi)免疫反應。當前的研究中S100A12 在諸多疾病中的價值已得到證實[7]。S100A12 蛋白能夠調節(jié)許多基因的表達，激活炎性細胞，有化學趨化和抗微生物作用。其水平在慢性炎癥如類風濕性關節(jié)炎、腸胃炎性疾病和囊性纖維病中有所上升[8]。同時，S100A12與其晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)在促炎性反應中起到重要作用，兩者結合后通過核因子κB(NF-κB)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路進行信號傳導，使單核吞噬細胞、淋巴細胞和內(nèi)皮細胞活化，導致促炎性細胞因子的合成與分泌[9]。另外，S100A12與鋅離子的親和力也較高[10]。本研究結果中健康對照組、輕、中、重慢性牙周炎組的齦溝液中S100A12的濃度呈逐漸增加趨勢，并且除了健康對照組和輕度慢性牙周炎組差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此推測，S100A12牙周炎中起著一定的作用，能作為判定炎性牙周疾病的潛在指標。

MMP-8由骨髓分化的粒細胞合成，也稱膠原酶，存在于中性粒細胞中，激活后能降解細胞外基質、促進新生血管形成、調節(jié)細胞黏附、激活蛋白。其主要由PMN分泌，與鋅有一定的親和力，催化機制都依賴于活性中心的鋅離子存在[11-12]。研究[13]證實MMP-8與牙齦炎密切相關。有學者用小鼠建立牙周炎模型[3]，研究MMP-8水平的改變，結果顯示該蛋白在急性炎癥期明顯升高；當病程進入慢性期，炎細胞浸潤減少，牙周組織中MMP-8的表達也明顯降低。之后又有學者發(fā)現(xiàn)，即使是炎癥由急性期轉為慢性期，齦溝液內(nèi)的蛋白水平仍較健康組織高出許多[14]。說明MMP-8水平與組織損傷密切相關，牙周組織損傷在牙周袋底，也是分泌齦溝液和產(chǎn)生MMP-8的地方。MMP-8廣泛存在于血清、齦溝液、唾液等中[2]。Gupta et al[15]研究發(fā)現(xiàn)MMP-8牙周臨床指標高度相關。大量的研究證實了MMP-8可以作為牙周炎癥進展期的一個重要標志。本實驗結果與之前的研究相吻合，隨著炎癥加重，MMP-8的濃度逐漸增高。

本研究結果顯示從健康對照組到慢性牙周炎組，S100A12和MMP-8水平明顯升高，并且除健康對照組和輕度慢性牙周炎組比較差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明S100A12和MMP-8都能作為炎性牙周疾病潛在的生化指標。其中健康對照組和輕度慢性牙周炎組比較差異無統(tǒng)計學意義，這可能是由于輕度慢性牙周炎炎癥較輕，對患者牙周組織破壞程度不重導致。

齦溝液中S100A12、MMP-8與牙周臨床指標均呈正相關性，且相關性較強，說明兩者的濃度與牙周臨床指標密切相關。齦溝液中S100A12和MMP-8水平呈正相關且相關性大。通過之前對兩者生化性能的分析，發(fā)現(xiàn)兩者有很多相似之處。S100A12和MMP-8都由PMN分泌，存在于血液、唾液、齦溝液等體液中，鋅離子的親和力大，都通過與RAGE結合，在炎性疾病中發(fā)揮作用。然而，目前還沒有文獻提及在牙周炎中兩者相互作用關系及機制，有待于進一步實驗研究。

本次實驗以牙位為單位，樣本量較小，可能導致結果有一定的偏差,需要擴大樣本量,使結果更具有說服力。

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