基于GEO數(shù)據(jù)庫研究缺氧肺癌中GBE1的表達(dá)和意義

丁 翔，葛圣林，張朝東

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均位居全球癌癥首位[1]。最新研究[2]顯示，2015年我國因肺癌死亡61萬例，占所有癌癥死亡人數(shù)的21.7%，死亡率居我國各種癌癥死亡率之首。非小細(xì)胞肺癌(normal small cell carcinoma,NSCLC)是肺癌最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的87%。研究[3]顯示，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力及新生血管的形成有重要影響，是腫瘤不斷惡化并發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因。而缺氧在細(xì)胞增殖、血管生成、免疫監(jiān)控、新陳代謝，以及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[4]。腫瘤細(xì)胞在應(yīng)對(duì)缺氧微環(huán)境時(shí)，能夠上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)。葡萄糖是腫瘤無氧酵解主要的能量供給物質(zhì)，在細(xì)胞中能夠以糖原的形式儲(chǔ)存，儲(chǔ)存糖原是腫瘤細(xì)胞在應(yīng)對(duì)缺氧和營養(yǎng)不足時(shí)的能量來源和生存保障。有研究[5]表明，低氧刺激能夠提高腫瘤細(xì)胞中糖原水平，并誘導(dǎo)糖原代謝相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。低氧引發(fā)的糖原合成升高，與糖原合成相關(guān)酶的表達(dá)水平升高相關(guān)，包括 UGP2、GYS1、GBE1、PGM 和 PPP1R3C。

糖原分支酶(glucogen branching enzyme 1,GBE1)是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，屬α-淀粉酶家族成員。在糖原合成的過程中，能夠催化水解α-1，4-糖苷鍵，將直鏈糖轉(zhuǎn)化成分支糖[6]。有報(bào)道[7-8]稱GBE1 在卵巢癌、宮頸癌等腫瘤中的表達(dá)水平不同，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但GBE1在肺癌中的作用尚未有報(bào)道。因此，該研究以GEO數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，首次探討GBE1在肺癌缺氧狀態(tài)下抑制細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1試劑人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Lipo2000、青霉素-鏈霉素溶液、PVDF膜和預(yù)染蛋白Marker購自美國Life technology公司；30% 甲叉雙丙烯酰胺溶液購自南京厚百公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、細(xì)胞裂解液、PMSF和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；GBE1 siRNA(貨號(hào)：sc-78413)及對(duì)照siNC購自美國Santa Cruz公司；GBE1質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；β-actin (貨號(hào)：ab8226)和GBE1(貨號(hào)：ab180596)抗體購自美國Abcam公司；cleaved-caspase-3(貨號(hào)：#9664)、bax(貨號(hào)：#2774)和 bcl-2(貨號(hào)：#4223)抗體購自美國CST公司；Real-time PCR引物由南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：RR047A)與SYBR(貨號(hào)：RR430A)購自大連TaKaRa有限公司。

1.2儀器全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio Rad公司)；三氣培養(yǎng)箱(型號(hào)3131，美國Thermo公司)；Step one Plus Real-time PCR擴(kuò)增儀(美國Life technology公司)；Tanon 5200 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能公司)。

1.3方法

1.3.1基于GEO肺癌芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 在基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載肺癌基因芯片數(shù)據(jù)。每個(gè)數(shù)據(jù)集均需符合以下條件:① 數(shù)據(jù)集來自全基因組RNA表達(dá)芯片；② 實(shí)驗(yàn)使用人類缺氧肺癌者組織與常氧肺癌組織對(duì)照。經(jīng)過篩選，下載基因表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)集GSE30979[9]中10例缺氧組織和10例常氧組織。將這兩組芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入GCBI(https://www.gcbi.com.cn)在線平臺(tái)進(jìn)行差異基因分析，并對(duì)差異基因進(jìn)行Gene ontology功能富集分析(GO分析)，最后基于KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。

1.3.2細(xì)胞常氧和低氧培養(yǎng) 細(xì)胞常氧培養(yǎng)的條件：A549細(xì)胞用含10% FBS、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于 37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞低氧培養(yǎng)的條件：培養(yǎng)液同常氧培養(yǎng)的細(xì)胞，置于37 ℃、O2體積分?jǐn)?shù)為1%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%和N2體積分?jǐn)?shù)為94%的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h[10]。6孔板每孔轉(zhuǎn)染50 pmol siRNA，96孔板每孔轉(zhuǎn)染5 pmol siRNA。將siRNA與Lipofectamine 2000混合加入無血清DMEM培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置5 min，加入培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行缺氧處理。A549細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染siGBE1或高表達(dá)GBE1的質(zhì)粒24 h后，缺氧處理24 h，Western blot檢測細(xì)胞GBE1、cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白表達(dá)水平，real-time PCR法檢測細(xì)胞GBE1、bcl-2和bax mRNA水平。

1.3.3MTT 法檢測 GBE1對(duì)A549缺氧后細(xì)胞活力的影響 將A549懸液調(diào)整為1×105/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，分別用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒和GBE1質(zhì)粒，每組6個(gè)復(fù)孔，48 h后各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μl DMSO，測定在570 nm下的吸光度。

1.3.4Real-time PCR A549細(xì)胞接種于6孔板中，加入TRIzol提取RNA，根據(jù)試劑盒反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行Real-time PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，各指標(biāo)的PCR引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物：5′- ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′； GBE1上游引物：5′- GGAGATCGACCCGTACTTGAA-3′，下游引物：5′- ACATCTGTGGACGCCAAATGA-3′；bcl-2上游引物：5′- GTCTTCGCTGCGGAGATCAT-3′，下游引物：5′-CATTCCGATATACGCTGGGAC-3′；bax上游引物：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游引物：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′；按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：擴(kuò)增曲線的反應(yīng)條件為95 ℃、5 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃、5 s，60 ℃、60 s，共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線的反應(yīng)條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，之后用2-ΔΔCt法定量分析目的基因表達(dá)情況。

1.3.5Western blot 檢測caspase-3、bax和 bcl-2 蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1 × 105個(gè)/ml接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長至融合度為70%時(shí)轉(zhuǎn)染siNC和siGBE1，缺氧處理24 h后每孔用100 μl RIPA裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心后取上清液。BCA 法測量樣品中總蛋白濃度。取蛋白樣品(30 μg/孔)加入10%聚丙烯酰胺凝膠，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入一抗(cleaved-caspase-3、bax和bcl-2按1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗(1 ∶5 000稀釋)，常溫孵育 1 h，最后加 ECL 發(fā)光液，用天能5200曝光儀拍照。

2 結(jié)果

2.1差異基因GCBI平臺(tái)對(duì)上傳的原始芯片數(shù)據(jù)，首先進(jìn)行芯片信號(hào)值的預(yù)處理與預(yù)過濾，然后使用差異分析方法，對(duì)2組基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因的篩選。差異基因的篩選條件為：Q值<0.05，得到206個(gè)差異基因，其中上調(diào)的基因82，下調(diào)的基因124。本研究選取差異最大的20個(gè)基因進(jìn)行排序并聚類分析?；虮磉_(dá)譜的聚類結(jié)果見圖1，GBE1在缺氧肺癌組織中的表達(dá)水平較常氧組織相比升高2.32倍，是兩組基因芯片差異最大的基因。

2.2GO富集分析將206個(gè)差異基因用DAVID軟件進(jìn)行GO富集分析(FDR<0.01)，結(jié)果顯示這些基因富集在細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等生物學(xué)進(jìn)程和核分裂調(diào)控等分子功能上。GO富集排名前20的結(jié)果見表1。由表1可知，肺癌組織缺氧可能會(huì)影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程(GO:0005975)和小分子代謝過程(GO:0044281)。

表1 GO富集分析結(jié)果

圖1 差異基因的聚類圖

注：紅色代表相對(duì)較高的表達(dá)，綠色代表相對(duì)較低的表達(dá)，黑色代表沒有變化，每一列代表一個(gè)樣本，每一行代表一個(gè)基因

2.3KEGG通路分析將206個(gè)差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示這些基因顯著富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞代謝等30個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)通路(P<0.05)，Pathway分析排名前10的通路見表2。

表2 KEGG通路分析結(jié)果

2.4GBE1對(duì)A549缺氧后的細(xì)胞活力的影響與常氧組相比，缺氧可以分別增加A549細(xì)胞GBE1蛋白和mRNA水平(2.67±0.28)倍(P=0.0091)和(2.45±0.31)倍(P=0.008 5)；轉(zhuǎn)染siGBE1后，A549細(xì)胞GBE1的蛋白和mRNA水平分別降低(0.52±0.09)倍(P=0.007 8)和(0.45±0.07)倍(P=0.008 3)倍；轉(zhuǎn)染GBE1高表達(dá)質(zhì)粒后，A549細(xì)胞GBE1的蛋白和mRNA的表達(dá)水平分別升高(3.39±0.54)倍(P=0.000 3)和(5.53±0.64)倍(P=0.000 6)，見圖2A、2B。

缺氧24 h后，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，與正常組相比，缺氧組A549細(xì)胞活力降低至(0.41±0.06)倍(P=0.006 2)，轉(zhuǎn)染siGBE1后A549細(xì)胞活力進(jìn)一步降低至(0.23±0.04)倍(P=0.032 1)，而高表達(dá)GBE1可以升高缺氧造成的細(xì)胞活力至(0.89±0.12)倍(P=0.007 7)，見圖2C。

圖2 GBE1對(duì)A549缺氧后的細(xì)胞活力的影響

A：Western blot檢測A549細(xì)胞GBE1蛋白的表達(dá)水平；B：Real-time PCR檢測A549細(xì)胞GBE1 mRNA水平；C：MTT法檢測A549細(xì)胞活力；1：常氧對(duì)照組；2：缺氧組；3：siGBE1+缺氧組；4：GBE1+缺氧組：與常氧對(duì)照組比較：**P<0.01；與缺氧組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.5GBE1對(duì)A549細(xì)胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達(dá)的影響與常氧組相比，缺氧能夠顯著增強(qiáng)cleaved-caspase-3和bax蛋白表達(dá)水平(5.48±0.43)倍(P=0.000 2)和(4.29±0.37)倍(P=0.000 9)，降低bcl-2表達(dá)至(0.21±0.06)倍(P=0.008 1)。敲降GBE1能夠進(jìn)一步上調(diào)cleaved-caspase-3和bax表達(dá)(6.98±0.67)倍(P=0.001 3)和(6.72±0.90)倍(P=0.008 3)倍，降低bcl-2表達(dá)至(0.13±0.02)倍(P=0.012 9)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而高表達(dá)GBE1可以降低cleaved-caspase-3和bax表達(dá)水平分別至(1.48±0.23)倍(P=0.001 2)和(2.78±0.36)倍(P=0.001 2)，升高bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)水平至(0.88±0.06)倍(P=0.002 5)和(0.78±0.11) 倍(P=0.002 3)，逆轉(zhuǎn)缺氧造成的細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 GBE1對(duì)A549細(xì)胞缺氧處理后caspase-3、bax和bcl-2表達(dá)的影響

A： Western blot檢測A549細(xì)胞cleaved-caspase-3、bcl-2和bax蛋白的表達(dá)水平；B：Real-time PCR檢測A549細(xì)胞bax和bcl-2 mRNA水平；1:常氧對(duì)照組；2:缺氧組；3:siGBE1+缺氧組；4:GBE1+缺氧組;與常氧對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01;與缺氧組比較：#P<0.05

3 討論

近年來，隨著我國環(huán)境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下。這一方面是由于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、易感人群遺傳基因異常等引起，另一些方面是由于肺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制不明[11]。因此，深入研究肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其分子機(jī)制，可以更加準(zhǔn)確的評(píng)估患者的預(yù)后，并找出新的藥物治療靶點(diǎn)。本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫和GCBI分析平臺(tái)首次發(fā)現(xiàn)，GBE1在缺氧肺癌組織中異常高表達(dá)，可能與肺癌的缺氧耐受和代謝異常相關(guān)。為進(jìn)一步揭示GBE1在肺癌缺氧耐受中作用機(jī)制，筆者分別向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA和GBE1的質(zhì)粒，在缺氧條件下檢測A549細(xì)胞的活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，探討GBE1在缺氧肺癌中的意義。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，基因芯片作為一種高效、大規(guī)模獲取生物信息的技術(shù)得到越來越廣泛的應(yīng)用。GEO數(shù)據(jù)庫是由美國國家生物技術(shù)中心(national center of Biotechnology Information,NCBI)開發(fā)的用于存儲(chǔ)和查詢基因芯片數(shù)據(jù)的綜合性數(shù)據(jù)庫，為全世界生物工作者進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘提供了良好的平臺(tái)[12]。本研究顯示，在缺氧肺癌組織中GBE1異常高表達(dá)，這可能與肺癌的缺氧耐受有關(guān)；對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)肺癌組織缺氧可能會(huì)影響GBE1所涉及的碳水化合物代謝過程和小分子代謝過程，而這些差異基因顯著富集于細(xì)胞代謝等信號(hào)通路。這些結(jié)果同樣證實(shí)，GBE1在肺癌缺氧耐受中具有十分重要的作用。

糖原分支的形成一方面增加了糖原水溶性，有利于其貯存，另一方面可為糖原結(jié)合蛋白提供對(duì)接位點(diǎn)[13]。糖原不僅能夠在無氧的條件下快速代謝為ATP，為腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)營養(yǎng)和氧氣匱乏時(shí)提供能量支持，維持細(xì)胞的生存，而且在蛋白翻譯后的修飾、生物合成以及抗氧化保護(hù)過程中發(fā)揮重要作用[14]。但是GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用卻鮮有報(bào)道。

本研究分別向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染siGBE1和GBE1高表達(dá)質(zhì)粒，缺氧處理24 h后，檢測GBE1的蛋白和mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)缺氧能夠增加A549細(xì)胞GBE1蛋白和mRNA的表達(dá)。通過MTT法檢測細(xì)胞活力，Western blot和Real-time PCR檢測凋亡相關(guān)cleaved-caspase-3、bcl-2和bax表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染敲降GBE1后，可以加重缺氧造成的的細(xì)胞活力降低，增加促凋亡因子cleaved-caspase-3、bax的表達(dá)水平，降低凋亡抑制因子bcl-2的表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；高表達(dá)GBE1則有相反的效果。因此，GBE1能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞缺氧條件下的代謝，從而使細(xì)胞產(chǎn)生缺氧耐受，抑制GBE1的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的缺氧耐受，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

通過GEO基因芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的方法尋找新靶點(diǎn)和研究方向具有便捷、數(shù)據(jù)量大的特點(diǎn)，但還需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)利用數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn) GBE1的表達(dá)與肺癌缺氧顯著相關(guān)，并通過A549細(xì)胞設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果，證明了GBE1在肺癌缺氧耐受中的作用。綜上所述，GBE1可以作為治療肺癌缺氧耐受的新靶點(diǎn)，為未來肺癌臨床治療的研究提供新的方向。

[1] Manegold C and Thatcher N. Survival improvement in thoracic cancer:progress from the last decade and beyond[J]. Lung Cancer,2007,57 Suppl 2(2):S3.

[2] Chen W,Zheng R,Baade P D,et al. Cancer statistics in China,2015[J]. CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-32.

[3] Kessenbrock K,Plaks V,Werb Z. Matrix metalloproteinases:regulators of the tumor microenvironment[J]. Cell,2010,141(1):52-67.

[4] Zeng W,Liu P,Pan W,et al. Hypoxia and hypoxia inducible factors in tumor metabolism[J]. Cancer Lett,2015,356(2):263-7.

[5] Zois C E,Favaro E,Harris A L. Glycogen metabolism in cancer[J]. Biochemical Pharmacology,2014,92(1):3-11.

[6] Said S M,Murphree M I,Mounajjed T,et al. A novel GBE1 Gene variant in a child with glycogen storage disease type IV[J]. Hum Pathol,2016,54:152-6.

[7] Cody N A,Shen Z,Ripeau J S,et al. Characterization of the 3p12.3-pcen region associated with tumor suppression in a novel ovarian cancer cell line model genetically modified by chromosome 3 fragment transfer[J]. Mol Carcinog,2009,48(12):1077.

[8] Lando M,Wilting S M,Snipstad K,et al. Identification of eight candidate target genes of the recurrent 3p12-p14 loss in cervical cancer by integrative genomic profiling[J]. J Pathol,2013,230(1):59-69.

[9] Leithner K,Wohlkoenig C,Stacher E,et al. Hypoxia increases membrane metallo-endopeptidase expression in a novel lung cancer ex vivo model - role of tumor stroma cells[J]. BMC Cancer,2014,14(1):40.

[10] Wu H M,Jiang Z F,Ding P S,et al. Hypoxia-induced autophagy mediates cisplatin resistance in lung cancer cells[J]. Sci Rep,2015,5:12291.

[11] De M S,Consonni D,Bertazzi P A. Exposure to occupational carcinogens and lung cancer risk. Evolution of epidemiological estimates of attributable fraction[J]. Acta Biomed,2008,79 Suppl 1(suppl 1):34.

[12] Barrett T,Wilhite S E,Ledoux P,et al. NCBI GEO:archive for functional genomics data sets-update[J]. Nucleic Acids Res,2013,41(Database issue):D991-5.

[13] Ritterson L C,Guin S,Theodorescu D. Targeting glycogen metabolism in bladder cancer[J]. Nat Rev Urol,2015,12(7)：383-91.

[14] Zois C E，Harris A L. Glycogen metabolism has a key role in the cancer microenvironment and provides new targets for cancer therapy[J]. J Mol Med (Berl),2016,94(2):137.