魚貝肌肉分離蛋白糖基化功能改性的研究與比較

姜夢云，周晏琳，張 晴，劉慧慧，田元勇，劉俊榮*

人類對海洋資源的深度開發(fā)，一方面捕獲了大批未被充分利用的物種（南極磷蝦和鯡魚等），另一方面制造了大量水產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物（魚頭、魚骨和魚皮等）。本質(zhì)上，它們和“魚肉”一樣同屬優(yōu)質(zhì)蛋白，有關(guān)將其中的蛋白質(zhì)分離回收，轉(zhuǎn)化成人類食品的研究從未中斷。然而，傳統(tǒng)魚糜對原料要求較高，顯然不具備回收分離此類蛋白質(zhì)的能力。與傳統(tǒng)魚糜相比，分離魚蛋白在蛋白質(zhì)分離回收方面具有明顯優(yōu)勢。目前的研究表明，分離魚蛋白具有脫脂、脫臭和脫色等諸多優(yōu)點，完全有潛力成為新型食品蛋白配料。

多數(shù)魚蛋白都面臨蛋白質(zhì)受熱變性，自溶降解的風(fēng)險，導(dǎo)致其食品功能特性受損，甚至影響人類食用。常見解決方法有在貯藏或加工過程抑制蛋白質(zhì)變性，如低溫冷藏和水洗處理等；再者是通過技術(shù)手段提高蛋白質(zhì)的功能特性，即蛋白質(zhì)改性。主流的改性方法有高壓處理，提高六齒金線魚[1]、梅魚[2]等的凝膠性；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)，提高竹莢魚[3]、鯉魚[4]及虹鱒[5]等的凝膠性；糖基化，提高鯉魚[6]、鰱魚[7]、黑皮旗魚[8]、蝦夷扇貝[9]和狗鮭[10]等乳化性、熱穩(wěn)定性和溶解性；酶解，提高石首魚[11]、鰹魚[12]、鰻魚[13]、阿根廷魷魚[14]、近江牡蠣[15]的溶解性、乳化性、吸油性和發(fā)泡性。不難看出，蛋白質(zhì)改性適用于各類水產(chǎn)動物及其副產(chǎn)物，對它們的凝膠性、乳化性、溶解性和發(fā)泡性等重要食品功能特性均有改善作用。可見，蛋白質(zhì)改性通過修復(fù)魚蛋白受損的功能特性，使食用性差的魚蛋白原料能夠被人類接受作為食品蛋白，進(jìn)而幫助水產(chǎn)蛋白實現(xiàn)資源最大化利用。

本研究以櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和鯉魚（Cyprinus carpio）為研究對象，比較二者分離蛋白的糖基化效果，并對比扇貝分離蛋白糖基化（直接糖基化）和分離蛋白先經(jīng)酶修飾后糖基化（間接糖基化）的功能改善作用，以探索功能性食品蛋白配料新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

活櫛孔扇貝購于大連新長興水產(chǎn)品市場，殼長（6±0.5）cm。30 min內(nèi)運(yùn)輸至實驗室，取閉殼肌，冰中保藏?；铛庺~購于大連沃爾瑪（軟件園）超市，質(zhì)量（1.5±0.2）kg?，F(xiàn)場速殺，去頭、內(nèi)臟、魚鱗，15 min內(nèi)運(yùn)輸至實驗室，取白色背肌，冰中保藏。

糖化血清蛋白測試盒 南京建成生物工程研究所；MD34透析袋（8 000～14 000 kDa）、胰凝乳蛋白酶、葡萄糖（分析純） 北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑 美國Sigma公司；氯化鈉、硫酸銅（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

BS224S分析天平、BS224S型精密電子天平 北京賽多利斯有限公司；垂直平板電泳槽 北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；79-1磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；IMS-25制冰機(jī) 常州市雪科電器有限公司；721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離蛋白制備

用堿溶出法制備扇貝、鯉魚的分離蛋白[16]。取剁碎的肉糜與4 倍體積的冷蒸餾水混合，10 000 r/min條件下均質(zhì)90 s。用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至12.0，冰水浴條件下攪拌30 min，10 000×g離心15 min，收集上清液為堿溶蛋白，用3 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥后即為扇貝分離魚蛋白（fish protein isolate of scallop，F(xiàn)PIs）和鯉魚分離魚蛋白（fish protein isolate of carp，F(xiàn)PIc）。

1.2.2 胰凝乳蛋白酶修飾

選用胰凝乳蛋白酶對扇貝堿溶蛋白進(jìn)行酶修飾[17]。將堿溶蛋白用3 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至8.0，30 ℃水浴預(yù)熱5min，酶和蛋白質(zhì)量比為1∶100，30 ℃水浴加熱1 h，1 mmol/L苯甲基磺酰氟滅酶活，冷凍干燥后即為經(jīng)酶修飾的分離蛋白（H-FPIs）。

1.2.3 糖基化

反應(yīng)體系內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度為12 mg/mL，蛋白和葡萄糖質(zhì)量比為1∶5，糖基化反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)相對濕度為65%，反應(yīng)時間分別為0、2、4 h和6 h。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品立即置于冰水浴中冷卻降溫，與15 mL蒸餾水混合，7 000 r/min均質(zhì)30 s，調(diào)pH值至7.0，即為糖基化產(chǎn)物。

1.2.4 指標(biāo)測定

賴氨酸含量測定：將糖基化產(chǎn)物4 000×g離心15 min，取上清液進(jìn)行分析。按照Goodno等[18]方法進(jìn)行測定。160 mg鄰苯二甲醛（o-phthaldehyde，OPA）用4 mL 95%乙醇溶液溶解；2 g十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）用10 mL蒸餾水溶解；38.1 g硼砂用蒸餾水溶解后，用氫氧化鈉調(diào)pH 9.5，加水定容至1 L；將2 mL OPA、5 mL SDS、50 mL硼砂及0.2 mL巰基乙醇用水定容至100 mL，即為OPA試劑，當(dāng)天使用。賴氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。50 μL樣液與2 mL OPA試劑混合，靜置2 min，于波長340 nm處測吸光度。

果糖胺含量[19]測定：將糖基化產(chǎn)物4 000×g離心15 min，將上清液透析24 h后進(jìn)行分析。按照試劑盒方法測定。50 μL樣液與1 mL試劑混合，37 ℃水浴加熱15 min，室溫條件下冷卻，于波長530 nm處測吸光度。

吸光度測定[20]：將糖基化產(chǎn)物4 000×g離心15 min，取上清液進(jìn)行分析。0.2 mL樣液與1 mL 0.1% SDS混勻，于波長420 nm處測吸光度。

SDS-PAGE分析：使用SDS-UM蛋白上樣液將糖基化產(chǎn)物稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1～2 mg/mL，充分溶解后100 ℃加熱5 min。樣品進(jìn)樣量為10～15 μL。用8%分離膠，6%濃縮膠配制膠板。

乳化性測試[21]：使用蒸餾水將糖基化產(chǎn)物稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。2 mL大豆油與8 mL樣品混合，13 500 r/min均質(zhì)1 min，迅速從底部取50 μL，與5 mL 0.1% SDS混合，于波長500 nm處測吸光度。乳化性按下式計算：

式中：A500nm為吸光度；F為稀釋倍數(shù)（100）；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（0.005 g/mL）；φ為油相占體積比（0.25）。

熱穩(wěn)定性測定[22]：使用蒸餾水將糖基化產(chǎn)物稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。70 ℃水浴加熱15 min，反應(yīng)結(jié)束后，冰水浴冷卻，4 000×g離心15 min，使用雙縮脲法測定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均進(jìn)行了3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值表示，用Excel 2010軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚貝分離蛋白糖基化特性的分析比較

圖1 鯉魚肌肉與櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白糖基化程度Fig. 1 Characterization of glycosylation of protein isolates from Cyprinus carpio muscle and Chlamys farreri adductor muscle

如圖1所示，鯉魚與扇貝分離蛋白的糖基化程度相同。隨反應(yīng)的進(jìn)行，糖基化組（FPIs-G和FPIc-G）的賴氨酸質(zhì)量濃度減少；果糖胺濃度逐漸積累；肌球蛋白重鏈和肌動蛋白的電泳條帶遷移率降低且有大分子質(zhì)量新條帶出現(xiàn)，顯示交聯(lián)聚集發(fā)生；而對照組（FPIs-C和FPIc-C）4 個指標(biāo)均不發(fā)生改變。其中，反應(yīng)6 h后，鯉魚（FPIc-G）的賴氨酸質(zhì)量濃度從356.54 μg/mL減少到143.02 μg/mL，下降59.89%，扇貝（FPIs-G）賴氨酸質(zhì)量濃度從1 857.56 μg/mL減少到1 282.90 μg/mL，下降30.94%；FPIc-G吸光度在0.000基本保持不變，F(xiàn)PIs-G吸光度0.023增加到0.084；FPIc-G果糖胺濃度從0.28 mmol/L增加到3.04 mmol/L，F(xiàn)PIs-G果糖胺濃度從0.25 mmol/L增加到2.99 mmol/L。由此可見，鯉魚賴氨酸初始質(zhì)量濃度低于扇貝，但賴氨酸下降率高于扇貝；鯉魚吸光度初始值低于扇貝，且褐變程度小于扇貝；兩者果糖胺濃度和電泳變化情況相似。

分離魚蛋白的糖基化研究鮮見系統(tǒng)報道。目前，多數(shù)魚蛋白糖基化的研究是圍繞特異蛋白組分開展的，如Saeki[23]以鯉魚的肌原纖維蛋白為研究對象，整個反應(yīng)過程無褐變發(fā)生；Maitena等[24]對鯉魚的肌球蛋白進(jìn)行糖基化后發(fā)現(xiàn)，72 h才發(fā)生顯著褐變；二人均認(rèn)為其研究中的鯉魚糖基化反應(yīng)屬于美拉德早期反應(yīng)，是不會生成引起褐變的類黑素。Wahyuni等[8]利用葡萄糖對黑皮旗魚水溶性蛋白進(jìn)行糖基化，60 ℃條件下反應(yīng)6 h，賴氨酸含量減少35%，果糖胺含量顯著增加，僅發(fā)生輕微褐變；Decourcelle等[25]對北極甜蝦酶解物進(jìn)行木糖接枝后，賴氨酸含量減少30.2%，體系pH值從8.39降至5.72；Nishimura等[26]用褐藻膠寡糖交聯(lián)狗鮭肌原纖維蛋白，60 ℃條件下反應(yīng)6 h，賴氨酸含量減少41%，結(jié)合糖含量為74.8 μg/mg。Katayama等[27]則對比鯉魚和蝦夷扇貝進(jìn)行了比較研究，針對肌球蛋白尾部組分（胰凝乳蛋白酶消化）糖基化程度時，反應(yīng)前6 h，鯉魚消耗的賴氨酸含量遠(yuǎn)大于扇貝，12 h時兩者持平（鯉魚69%，扇貝73%）。結(jié)合上述同類研究可得，各種水產(chǎn)動物，如脊椎動物、雙殼類和甲殼類等均具備良好的糖基化效果，針對的蛋白組分具有特異性，如肌原纖維蛋白、酶解產(chǎn)物、水溶蛋白以及本研究中的分離蛋白等。盡管物種間糖基化程度存在差異，但糖基化程度主要由蛋白源、蛋白組分、處理方式以及糖基化條件決定，即當(dāng)不同蛋白源使用相同方式進(jìn)行蛋白質(zhì)提取和糖基化時，其反應(yīng)程度相似。

圖2 鯉魚肌肉與櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白糖基化產(chǎn)物功能特性Fig. 2 Functional properties of glycosylated protein isolates from Cyprinus carpio muscle and Chlamys farreri adductor muscle

如圖2所示，糖基化是一種有效分離魚蛋白功能改性方法，且對鯉魚和扇貝的乳化性和熱穩(wěn)定性的改善作用一致。對照組（FPIs-C和FPIc-C）乳化性基本不變，熱穩(wěn)定性大幅下降，而糖基化組（FPIs-G和FPIc-G）乳化性則逐漸增加，同時熱穩(wěn)定性下降明顯趨緩。從糖基化效果來看，F(xiàn)PIc-G在6 h后乳化性從7.39 m2/g增至14.08 m2/g，F(xiàn)PIs-G乳化性從12.35 m2/g增至16.44 m2/g；FPIc-G和FPIc-C的熱穩(wěn)定性分別下降14%和26%，F(xiàn)PIs-G和FPIs-C的熱穩(wěn)定性分別下降28%和50%。Maitena等[24]報道鯉魚肌球蛋白-褐藻膠寡糖產(chǎn)物經(jīng)過50 ℃、6 h加熱后，熱穩(wěn)定性沒有顯著減少，而對照組（鯉魚肌球蛋白）卻減少了63%；陳欣[28]對羅非魚肌原纖維蛋白-葡聚糖干熱反應(yīng)進(jìn)行實驗，乳化活性指數(shù)為1.908±0.013，乳化穩(wěn)定性指數(shù)為31.545±0.4，熱穩(wěn)定性為（43.53±0.55）%；Liu Yongle等[29]將鰹魚酶解物與褐藻膠進(jìn)行反應(yīng)后，乳化性和乳化穩(wěn)定性均顯著提高；Decourcelle等[30]北極甜蝦酶解物糖基化產(chǎn)物乳液的稠度指數(shù)從0.54 Pa·sn增加至4.72 Pa·sn，表觀黏度從0.27 Pa·s增至0.81 Pa·s。從上述研究可知，糖基化對功能改善作用適用于各種水產(chǎn)動物及其相關(guān)蛋白源類型，能夠賦予魚蛋白優(yōu)良的乳化性和熱穩(wěn)定性。值得注意的是，目前糖基化涉及的功能特性主要集中為乳化性和熱穩(wěn)定性，下一步可以嘗試對發(fā)泡性和凝膠性進(jìn)行探索。

2.2 胰凝乳蛋白酶修飾對分離蛋白糖基化的影響

如圖3所示，酶修飾對扇貝分離蛋白糖基化反應(yīng)有促進(jìn)作用。反應(yīng)6 h后，對照組（H-FPIs-C和FPIs-C）4 個指標(biāo)均無明顯變化。直接糖基化組（FPIs-G）的賴氨酸質(zhì)量濃度從1 857.56 μg/mL減少到1 282.90 μg/mL，下降30.94%，間接糖基化組（H-FPIs-G）賴氨酸質(zhì)量濃度從2 369.65 μg/mL減少到766.86 μg/mL，下降67.64%；FPIs-G吸光度從0.023增至0.084，增長265%，H-FPIs-G吸光度從0.015增至0.087，增長500%；FPIs-G果糖胺濃度從0.25 mmol/L增加到2.99 mmol/L，H-FPIs-G果糖胺濃度從0.50 mmol/L增加到5.72 mmol/L；H-FPIs-G的電泳各條帶遷移率減少幅度大于直接糖基化，表明，且交聯(lián)聚集的速率更快。推測原因是，分離蛋白經(jīng)酶修飾后，首先蛋白質(zhì)鏈變短，并且還暴露出更多的氨基，都更有利于與糖結(jié)合；另外蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致空間位阻改變，也幫助蛋白與糖結(jié)合。目前關(guān)于分離魚蛋白糖基化（直接糖基化）和分離蛋白先經(jīng)酶修飾后糖基化（間接糖基化）的比較缺乏系統(tǒng)報道，本研究作為初步探索性嘗試，得出酶修飾對分離魚蛋白糖基化反應(yīng)有促進(jìn)作用，可以為之后相關(guān)研究提供參考。

圖3 櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白與酶修飾物糖基化程度Fig. 3 Characterization of glycosylation of protein isolate and hydrolysate from Chlamys farreri adductor muscle

圖4 櫛孔扇貝閉殼肌的分離蛋白與酶修飾物糖基化產(chǎn)物功能特性Fig. 4 Functional properties of glycosylated protein isolate and hydrolysate from Chlamys farreri adductor muscle

如圖4所示，酶修飾可以提高分離蛋白糖基化的功能改善作用，分離魚蛋白可以通過復(fù)合改性（酶修飾加糖基化）獲得更好的功能特性。其中反應(yīng)6 h后，直接糖基化組（FPIs-G）的乳化性提高33.11%，間接糖基化組（H-FPIs-G）的乳化性提高37.38%；兩者熱穩(wěn)定性分別下降28%和3%。水產(chǎn)蛋白中圍繞酶修飾和糖基化復(fù)合改性對比的研究鮮見系統(tǒng)報道，但已有大量研究證實酶修飾是水產(chǎn)蛋白有效的功能改性方式，如石首魚[11]、鰹魚[12]、鰻魚[13]等，另外也有許多關(guān)于酶修飾物的糖基化研究，如王軍等[31]的金帶細(xì)鲹胰蛋白酶修飾物葡萄糖糖基化研究、Decourcelle等[30]的北極甜蝦酶解物研究及Liu Yongle等[29]的鰹魚酶解物研究等，且均表明糖基化可以改善酶修飾物的功能特性，將這兩類研究報道結(jié)合起來可得，酶修飾和糖基化復(fù)合改性可以改善水產(chǎn)蛋白功能性，此推論與本研究結(jié)論一致。而該復(fù)合改性針對大豆蛋白的研究較系統(tǒng)：Zhang Yating等[32]比較了大豆分離蛋白、大豆分離蛋白酶解物和大豆分離蛋白酶解物糖基化產(chǎn)物的功能特性，發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白的乳化性為86.137 8 m2/g，大豆分離蛋白酶解物的乳化性為91.577 8 m2/g，大豆分離蛋白酶解物-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的乳化性為109.077 8 m2/g；三者熱變性溫度依次為96.99、98.32 ℃和100.78 ℃；另有張晉博[33]在對大豆7S蛋白先進(jìn)行先糖基化修飾，后對其產(chǎn)物進(jìn)行胰蛋白酶酶解，得到大豆7S、大豆7S-葡聚糖糖基化產(chǎn)物和大豆7S-葡聚糖糖基化產(chǎn)物水解物的油-水界面的πsat分別為（13.8±0.5）、（17.3±0.6）mN/m和（19.2±0.5）mN/m，且大豆7S-葡聚糖糖基化產(chǎn)物水解物具有最高的乳液液滴表面吸附量。由此可見，無論是已商業(yè)化的大豆蛋白，亦或是尚處在研究階段的水產(chǎn)蛋白，蛋白質(zhì)經(jīng)過酶修飾和糖基化復(fù)合改性可以大大提高其功能特性。

3 結(jié) 論

本研究以分離魚蛋白為出發(fā)點進(jìn)行了糖基化功能改性嘗試，在分離魚蛋白的糖基化特性，無脊椎貝類和脊椎魚類不同蛋白源之間的差異，以及胰凝乳蛋白酶修飾對分離蛋白糖基化的促進(jìn)效果等方面獲得有價值的發(fā)現(xiàn)。對分離魚蛋白的糖基化功能改性的基本規(guī)律有了初步了解?？傮w研究結(jié)論為分離魚蛋白可以有效進(jìn)行糖基化且功能有所改善；魚類與貝類的分離蛋白糖基化特性基本沒有差異；分離魚蛋白可以通過復(fù)合改性，即胰凝乳蛋白酶修飾后再糖基化，可以獲得更好的功能特性。

本研究僅選擇胰凝乳蛋白酶作為工具酶，今后可以考慮結(jié)合不同蛋白酶，探討由蛋白特異性水解所帶來的具有不同功能性蛋白改性產(chǎn)物的可能性。此外，未來可繼續(xù)深入水產(chǎn)蛋白的復(fù)合改性研究，嘗試結(jié)合如羥甲基化等其他改性手段對蛋白質(zhì)進(jìn)行疊加修飾。

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