分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質譜法測定新疆蘋果中7 種農藥殘留

李俊芳，景偉文，李德強，潘 樂

蘋果生產對農藥的依賴性很大，其中使用的農藥為有機磷類、氨基甲酸酯類、有機氯類、擬除蟲菊酯類、苯氧乙酸類等，這使得蘋果存在較大的農藥殘留安全隱患。早在20世紀80年代，蘋果中的農藥殘留問題就開始受到廣泛關注。目前，我國蘋果農藥殘留標準涉及51 種農藥，9 種劇毒、高毒、高殘留農藥不得檢出（GB 2763—2014《食品中農藥最大殘留限量》）。蘋果作為新疆果農的主要經濟來源之一，一半以上用于出口，而因農藥殘留問題在對外貿易中造成巨大損失。因此，針對新疆蘋果種植特點，建立新疆蘋果中農藥多殘留的快速篩查方法，可快速、高效地對即將出口的新疆蘋果進行農藥殘留篩查，有效避免新疆果農的經濟損失，提高出口貿易成功率。

對于農藥多殘留的檢測，早期文獻報道多采用氣相色譜[1]或氣相色譜-質譜聯(lián)用[2-4]法，雖然這種方法分析速度較快，但受檢測器的限制，定性準確性相對較差，并且不適于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的農藥的分析檢測。高效液相色譜[5-6]和液相色譜-質譜聯(lián)用[7-11]等在樣品的測試范圍方面，發(fā)揮了較大的優(yōu)勢。但單純液相色譜定性能力有限，檢出限也往往難以滿足歐盟等對農藥殘留檢測的要求。傳統(tǒng)的液相色譜-質譜聯(lián)用法，通常配備的是分辨率低于10 000的低分辨質譜，在檢測中很難區(qū)分0.01 Da的質量差異，常出現(xiàn)假陽性結果。Q Exactive將四極桿和Orbitrap高分辨技術結合起來，在提高靈敏度和改善定性結果準確性的同時，大大提高了其定量能力，在小分子化學污染物的分析方面具有巨大的應用前景[12-17]。

但是，盡管用高分辨質譜，仍會存在±5×10－6Da的質量檢測偏差，造成5%假陽性結果。雖然采用母離子-子離子對進行確證可有效提高結果準確度，但前提是母離子必須能夠電離出子離子，其次其他化合物電離出的相同質荷比的子離子，也會被記入定量，同樣存在較大定量誤差。為了解決以上問題，Paul等[18]的研究利用四極桿結合軌道阱液相色譜-質譜聯(lián)用技術[19-23]的可變數(shù)據(jù)獨立采集（variable data-independent analysis，vDIA）模式代替全離子碎裂電離模式，使母離子與子離子相關聯(lián)，從而得到了很好的定性、定量結果。

本實驗優(yōu)化了快速樣品前處理技術QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）提取方法[24-27]、分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，d-SPE）凈化條件，并采用超高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質譜（ultra performance liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry，UPLC-HRMS/MS）[28-30]分離檢測新疆蘋果中7 種常見農藥多殘留量的可能性，建立了vDIA-UPLC-HRMS/MS檢測新疆蘋果中農藥多殘留量的分析方法。并將此方法應用于實際樣品的分析，獲得了較好的分析結果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果為新疆本地產，購于農貿批發(fā)市場。

吡蟲啉、毒死蜱、氰戊菊酯、辛硫磷、嘧啶磷、氯氰菊酯、殺撲磷標準品（純度＞99%） 農業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；甲醇、乙腈（均為色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；無水硫酸鎂、無水醋酸鈉、氯化鈉（用前在馬弗爐500 ℃灼燒4 h，冷卻后貯于干燥器中備用）、甲酸、醋酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑上海有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18封端的硅膠（C18E） 日本島津公司；0.2 μm有機相微孔濾膜 美國Thermo-Fisher公司；實驗用水為艾柯純水儀制備高純水。

1.2 儀器與設備

Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜系統(tǒng)（配有加熱電噴霧離子源（heated electrospray ionization，HESI）及Xcalibur 2.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統(tǒng)） 美國Thermo-Fisher公司；TD5A-WS離心機 上海湘儀離心機廠；HZQ-50H回旋振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo aQ C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相：5 mmol/L醋酸銨溶液（A）和0.1%甲酸-乙腈溶液（B），梯度洗脫見表1。流速0.2 mL/min，柱溫20 ℃；進樣量5 μL。

表1 流動相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient program of mobile phase

1.3.2 質譜條件

Q Exactive質譜儀配備HESI（正離子模式）；室內環(huán)境控制在溫度20 ℃、相對濕度40%；噴霧電壓：3.5 kV；HESI源溫度：300 ℃；離子源溫度：250 ℃；鞘氣壓力：35 arb；輔助氣壓力：10 arb；反吹氣壓力：0 arb；射頻電壓：55 V；源內氮氣99%；高能碰撞池及離子阱中的緩沖氣均為高純氮99.99%；每3 d用正離子校正液（包含咖啡因、四肽MRFA、ultrmark及四丁胺）校正一次正離子模式；所有定量數(shù)據(jù)均由全掃描/target-MS2模式得到，該模式是由全掃描模式聯(lián)合vDIA碎裂方式，依據(jù)碎片離子能量進行二級子離子掃描組成；全掃描質譜的分辨率為70 000 FWHM；自動增益控制設為1.0×106，最大離子進樣時間為100 ms；掃描范圍m/z 50～500；歸一化碰撞能量為35%。

1.3.3 樣品前處理方法

1.3.3.1 未加緩沖鹽的QuEChERS方法

稱取5.0 g試樣于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙腈，振蕩30 min，加入4.00 g無水硫酸鎂和1.00 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min，6 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液快速加入裝有0.75 g無水硫酸鎂和0.25 g PSA及0.25 g C18E的10 mL離心管中，快速手動振搖20 次，取上清液過0.2 μm有機相微孔濾膜，取5 μL濾液直接上機檢測。

1.3.3.2 加入酸性緩沖液的QuEChERS方法

將1.3.3.1節(jié)“加入10.0 mL乙腈、4.00 g無水MgSO4、1.00 g NaCl”改為“加入10.0 mL 1%醋酸-乙腈、4.00 g無水MgSO4、1.00 g無水醋酸鈉”；或改為“加入10.0 mL 0.1%甲酸-乙腈、4.00 g無水MgSO4、1.00 g NaCl”其余與1.3.3.1節(jié)一致。

1.3.4 實際樣品的測定

對烏魯木齊市購置的蘋果樣品，采用優(yōu)化方法進行處理，并采用不含目標化合物的蘋果樣品作為空白對照，進行條件優(yōu)化和方法驗證。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

農藥回收溶劑為乙腈，為減少色譜分離過程的波動，采用乙腈-水體系為流動相。采用Thermo aQ C18色譜柱分析，比較純水和0.1%甲酸溶液為流動相A、乙腈和0.1%甲酸-乙腈為流動相B的效果。在流動相水相中添加5 mmol/L醋酸銨、有機相中添加0.1%甲酸后，既有利于化合物的離子化，提高化合物的響應值，又有利于改善7 種農藥的峰形，因此選擇5 mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，0.1%甲酸-乙腈為流動相B。乙腈洗脫能力強，可減少雜質在色譜柱中的殘留，延長色譜柱壽命。除此之外，適量加入甲酸和乙酸銨可以抑制[M＋Na]＋峰的形成，促進[M＋H]＋峰的形成，能夠在一定程度上改變色譜峰峰形并增強其響應值，從而提高檢測的靈敏度。

采用優(yōu)化的最佳色譜條件（表1）對蘋果中常用的7 種農藥進行測定，7 種農藥混標色譜圖見圖1，出峰順序分別為吡蟲啉6.81 min、毒死蜱7.34 min、氰戊菊酯7.77 min、辛硫磷8.55 min、嘧啶磷9.26 min、氯氰菊酯9.27 min、殺撲磷9.71 min，峰形尖銳，靈敏度高。

圖1 7 種農藥的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of 7 pesticides

2.2 質譜條件的選擇

由于Q Exactive質譜儀結合四極桿質譜與Obitrap質譜各自的優(yōu)點，具有高分辨率和高靈敏度的特點。與三重四極桿質譜定量手段不同，Q Exactive質譜在全掃描結合dd-MS2模式下應用vDIA碎裂模式，同時進行全掃描和全范圍＋二級質譜掃描，具有更好的定性、定量準確度。在HESI＋模式下，對7 種農藥的質譜條件進行了優(yōu)化，分別采用全掃描和全掃描結合dd-MS2的子離子掃描方式，優(yōu)化得到了母離子、子離子及最佳碎裂能量，以響應值最大的子離子為定量離子，以相對豐度較高的兩個離子對為定性依據(jù)，增加了定性的準確度，從而得到了最優(yōu)的質譜條件（表2）。

表2 7 種農藥的質譜采集參數(shù)Table 2 Mass spectral parameters for 7 pesticides

采用Q Exactive質譜儀在UPLC-HRMS/MS條件下，對基質共存的多種農藥進行分析，結果發(fā)現(xiàn)在純溶劑中樣品的離子峰強度或大于或小于在基質中樣品的離子峰強度，說明基質在一定程度上影響著農藥的電離。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取劑的選擇

為找到最佳的提取劑，基于QuEChERS方法進行改進。QuEChERS方法中的提取劑對一些弱酸性農藥和穩(wěn)定性差的農藥回收率低，這與處理過程未考慮農藥本身的性質有關，在中性或弱堿性條件下處理樣品，使農藥分解，導致提取率偏低。本實驗針對這一問題，在提取農藥時，加入了甲酸或醋酸調節(jié)基質pH值環(huán)境，來改善蘋果中農藥的回收率。

為考察提取劑對7 種農藥的提取效果，選擇添加100 μg/kg的農藥混標的蘋果空白為實驗對象，分別采用原創(chuàng)QuEChERS方法中的提取劑乙腈，及改良后的提取劑0.1%甲酸-乙腈和1%醋酸-乙腈，對100 μg/kg混合加標的蘋果樣品進行提取，并按照1.3.3節(jié)對提取劑進行凈化。測定原創(chuàng)QuEChERS方法平均回收率為85%；以0.1%甲酸-乙腈為提取劑時平均回收率為103%，相對于原創(chuàng)方法，回收率有所提高，但偏差較大；以1%醋酸-乙腈為提取劑時平均回收率為99%，且波動?。ū?）。這主要是由于1%醋酸-乙腈為提取劑時，加入的鹽為醋酸鹽，構成醋酸-醋酸鈉的緩沖溶液，使得提取過程pH值控制在5左右，有利于農藥的提取。

表3 不同提取劑對回收率的影響Table 3 Influence of different extractants on the recovery

2.3.2 凈化劑的選擇

QuEChERS方法采用PSA為凈化劑，進行d-SPE凈化，PSA直接加入經鹽析分層的樣品提取液中以吸附基質中的干擾物，固相萃取時間不應過長，否則固相吸附劑也會吸附目標化合物，導致回收率降低，影響測定結果的準確性。因此，d-SPE過程在加入提取劑后，手動上下快速振搖20 次，立即過膜上機測試。

為考察不同凈化劑的凈化效果，同樣選擇添加100 μg/kg的農藥混標的蘋果空白為實驗對象，考察PSA、C18E、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）及其組合為凈化劑（保持總質量為500 mg），采用d-SPE法對提取劑進行凈化，其他步驟與1.3.3節(jié)同。

圖2 使用不同凈化劑的前處理方法對吡蟲啉的回收率Fig. 2 Recoveries of imidacloprid with various purification agents

由圖2可見，當添加GCB時，回收率均較低，這可能是由于其較強的吸附能力，吸附了少量農藥樣品的緣故。單獨使用PSA和C18E時回收率均可達90%以上，當組合使用兩種凈化劑回收率大大提高。凈化效果依次為PSA＋C18E＞PSA≥C18E＞PSA＋C18E＋GCB＞GCB，因此選擇PSA＋C18E為凈化劑。

2.3.3 樣品與分散劑比例的選擇

固定樣品提取劑1.0 mL，分別考察當分散劑PSA＋C18E分別為0.2、0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0 g時7 種農藥的回收情況。如圖3所示，表明物料比為1.0∶0.5時，凈化效果和回收率都比較好。

圖3 樣品與分散劑的比例Fig. 3 Effect of dispersing agent dosage on the recovery

因此，最終確定前處理方法：以1%醋酸-乙腈液為提取劑加入醋酸鈉作為鹽析試劑，構成pH值為5的緩沖提取劑；以PSA＋C18E為組合凈化劑，物料比為1.0∶0.5。

2.4 方法學驗證

方法學驗證結果（表4）表明該方法具有較好的回收率，所有農藥的回收率均在70%～120%之間。從表4還可看出，本方法檢出限（limits of detection，LOD）為0.003～0.1 mg/kg，定量限（limits of quantification，LOQ）為0.02～0.5 mg/kg，較為滿意。7 種農藥線性關系良好，可滿足每一個目標化合物的分析要求，相關系數(shù)均大于0.99。

以空白蘋果加標實驗（LOD和10×LOD兩個加標水平（由于線性范圍限制，針對氰戊菊酯和辛硫磷采用LOQ和10×LOQ兩個加標水平），取3 個獨立樣品進行測試），每組加標量平行做3 次，得到平均的回收率。由于電離增強效應及基質效應，使得吡蟲啉、辛硫磷和嘧啶磷的回收率略微偏高。驗證實驗表明，平均回收率在95%～119%之間，相對標準偏差小于10%（n=3）。

表4 方法學驗證結果Table 4 Figures of merit of the method

2.5 實際樣品的定量效果驗證

為了考察方法的定量準確性，采用建立的vDIAUPLC-HRMS/MS方法對實際蘋果樣品進行了兩個加標水平的測定。由表5可知，通過對空白樣品和加標樣品的對比分析，可以得到良好的定量結果。

表5 實際蘋果樣品分析驗證結果Table 5 Recoveries of pesticides from spiked apple samples

2.6 實際樣品的定性效果驗證

新疆蘋果中農藥類污染物質譜數(shù)據(jù)庫的建立，對新疆蘋果產業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。建立新疆蘋果中常用農藥的質譜數(shù)據(jù)庫，可快速、有效地定點篩查出新疆蘋果中殘留的農藥種類及含量，可有效提高日常篩查的工作效率，從而提高農藥污染物的確認能力和增加出口貿易成功率。

大量文獻表明，基質會干擾農藥的測定，因此，在構建標準譜庫時，應在基質共存下分析目標化合物。譜庫建立的流程如圖4所示。

圖4 數(shù)據(jù)庫建立及應用工作流程圖Fig. 4 Establishment and application of database to identify analytes in samples

因篇幅有限，此處以吡蟲啉為例，探討自建譜庫的流程。圖5為自建譜庫與標準譜庫的基質加標樣品中吡蟲啉母離子（m/z 256.059 58）及其碎片離子（m/z 209.059 40和m/z 175.097 82）的質量偏差對比，該結果是在蘋果基質中加標1×106Da后得到的，這與標準譜庫的做法一致，其次吡蟲啉和它的兩個主要碎片離子與標準譜庫進行對比，有較高的符合程度。子離子m/z 209.059 40和m/z 175.097 82在標準譜庫中與理論質量相比，質量偏差分別為－3.83×10－6Da和－6.68×10－6Da；而在自建譜庫中與理論質量相比，質量偏差分別為－6.17×10－6Da和－9.48×10－6Da。說明自建譜庫具有較好的質量精度。為考察所建立方法的適用性，本實驗對10 個蘋果樣品進行了分析，得到了較為滿意的結果。

圖5 自建譜庫與標準譜庫的基質加標樣品中吡蟲啉母離子（m/z 256.059 58）及其碎片離子（m/z 209.059 40和m/z 175.097 82）的質量偏差對比Fig. 5 Comparison of mass errors of parent (m/z 256.059 58) and fragment (m/z 209.059 40 and 175.097 82) ions imidacloprid in matrixmatched spiked calibration samples between standard library and spectral library established in this study

3 結 論

實驗建立了vDIA-UPLC-HRMS/MS法對新疆蘋果中的7 種常見農藥殘留進行分析，考察方法的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、加標回收率及相對標準偏差，同時對提取劑的種類、d-SPE的分散劑種類與物料比等參數(shù)進行優(yōu)化。通過建立新疆蘋果中常見農藥的質譜數(shù)據(jù)庫，分別考察建立方法的定性、定量能力。實驗結果表明，該方法具有較高的準確度，成本低且簡便、快速，具有良好的適用性與普遍的實用價值。

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