QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定牛奶中有機氯農(nóng)藥及多氯聯(lián)苯的分析

付文雯，羅 彤，朱 影，周陶鴻，文 紅，王會霞*

有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯屬于持久性環(huán)境有機污染物，雖已禁用多年，但由于其難降解，具有毒性、親脂性、半揮發(fā)性和生物富集性等特點，在土壤、沉積物、水和部分食品中仍能檢測到，并且通過生物富集和食物鏈對人體健康產(chǎn)生威脅，環(huán)境暴露和膳食暴露是人類面臨持久性有機污染物的兩大途徑[1-5]。因此，建立簡單、快速、有效的有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯的檢測方法，對于保證食品安全和保護人類健康具有重大的現(xiàn)實意義。

目前，有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯殘留量常用的檢測方法有氣相色譜電子捕獲檢測法、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-8]等。由于有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯在樣品中含量低，且食品基質(zhì)復(fù)雜，在分析前通常需要用有機溶劑輔助微波、超聲等進行提取、凝膠滲透色譜、固相萃取、基質(zhì)分散固相萃取[9-12]等方法進行凈化后再濃縮上樣分析。這樣不僅操作繁瑣而且耗時，靈活性不強，對前處理的輔助設(shè)備要求也高。QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）由美國化學(xué)家Lehotay等于2003年提出的一種用于蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品中多農(nóng)藥殘留量檢測的快速前處理技術(shù)[13-15]，其優(yōu)勢在于操作簡單、分析速度快、且回收率、準(zhǔn)確度等較高。QuEChERS是基于基質(zhì)分散萃取機理，其基本流程是采用乙腈提取，萃取鹽析分層，最后在有機層中加入吸附劑除去基質(zhì)干擾物達(dá)到凈化目的，目前，有超過200 種農(nóng)藥殘留可采用此方法進行測定[16]。根據(jù)不同樣品基質(zhì)以及不同目標(biāo)物的理化特性差異，可以通過調(diào)整提取溶劑、吸附劑等改進QuEChERS前處理技術(shù)，讓其應(yīng)用于更加廣泛的領(lǐng)域。根據(jù)資料顯示，該方法經(jīng)過改良后也應(yīng)用于動植物樣品中農(nóng)藥殘留[17-19]，其中還包括中藥材樣品[20]，茶葉中尼古丁[21]和動物源性食品中獸藥殘留[22-23]的檢測，但在牛奶樣品中的應(yīng)用報道較少。因此，本研究擬沿用QuEChERS方法的思路建立牛奶樣品的快速前處理方法，通過氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）分析樣品，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，建立QuEChERS-GC-MS/MS法檢測牛奶中有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯殘留的方法，為實現(xiàn)牛奶中有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯殘留的快速監(jiān)測提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶 市購；正己烷（色譜純）；有機氯標(biāo)準(zhǔn)品 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Accustandard公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）、弗羅里硅土填料、MgSO4、C18填料 北京迪馬科技有限公司；濃硫酸（優(yōu)級純）。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000 GC-MS/MS聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AIIegra X-22R多功能臺式冷凍離心機 美國貝克曼公司；XH-C渦旋混合器 江蘇金怡儀器科技公司；MSA125P-1CE-DU分析天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將8 種有機氯農(nóng)藥（六六六（α-hexachlorocyclohexane，α-HCH）、β-HCH、γ-HCH、δ-HCH、滴滴伊（pp’-dichlor odiphenyldichloroethylene，pp’-DDE）、滴滴滴（pp’-dichlorodiphenyldichlorothane，pp’-DDD）、滴滴涕（op’-dichlorodiphenyltrichloroethane，op′-DDT）、pp’-DDT）標(biāo)準(zhǔn)品和7 種多氯聯(lián)苯（2,4,6-三氯聯(lián)苯（2,4,6-trichlorobiphenyl，PCB28）、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷稀釋至1 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g樣品至50 mL離心管中，加入30%硫酸-甲醇2 mL，2 g無水硫酸鎂，陶瓷均質(zhì)子，渦旋5 min，放入－18 ℃冷凍5 min，加入10 mL正己烷溶液，渦旋5 min，以4 000 r/min離心3 min，取上層清液2 mL加入弗羅里硅土100 mg、C18150 mg、MgSO4200 mg，渦旋1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3.3 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱：HP-1701MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.32 mm，0.25 μm）；升溫程序：150 ℃保持1 min，以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持9 min；以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持8 min；進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；進樣方式：不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電子電離源；電離能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度270 ℃，溶劑延遲7.5 min，燈絲電流100 μA，多反應(yīng)監(jiān)測模式，其具體參數(shù)見表 1，有機氯和多氯聯(lián)苯的總離子流圖見圖1。

表1 有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯保留時間、定性及定量離子對Table 1 Retention times, qualitative ions and quantitative ions of organochlorine pesticide and polychlorinated biphenyls

圖1 有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatogram of organochlorine pesticide and polychlorinated biphenylsin standards

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的優(yōu)化

乳及乳制品基質(zhì)復(fù)雜，含有蛋白質(zhì)、脂類、酚類、碳水化合物等雜質(zhì)，在提取前對其進行一定處理，可以提高提取的效率。本實驗以純牛奶為研究對象，分別比較了在添加B（4% KOH-甲醇）、C（10%硫酸-甲醇）、D（亞鐵氰化鉀-乙酸鋅（1∶1））、E（3%乙酸）作用后對提取效率的影響（A為陰性對照），結(jié)果見圖2。

圖2 不同處理方式對提取效率的影響Fig. 2 Effect of different pretreatments on extraction efficiency

脂肪在堿性條件下水解生成甘油和高級脂肪酸的鈉鹽，采用KOH-甲醇進行前處理，可以有效降低牛奶里的脂肪含量[24-25]，從而提高提取的效率，除γ-HCH、δ-HCH外，其余指標(biāo)回收率均較高，可能是HCH在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性弱于酸性環(huán)境的原因。采用硫酸-甲醇進行甲酯化，高濃度的硫酸可以破壞牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪等有機物[26]，使樣品在一定程度上“碳化”，而且酸催化酯化在含水樣品中也可以進行[27]，因此硫酸-甲醇能很好地消除蛋白質(zhì)和脂肪的干擾，有利于下一步的提取，并且各指標(biāo)在酸性環(huán)境穩(wěn)定性均較好，采用10%硫酸-甲醇進行甲酯化后再進行提取各指標(biāo)的回收率均較高。

2.2 硫酸-甲醇體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

稱取5 份相同濃度的加標(biāo)樣品5.0 g，分別加入A（5%硫酸-甲醇）、B（10%硫酸-甲醇）、C（20%硫酸-甲醇）、D（30%硫酸-甲醇）、E（40%硫酸-甲醇）2 mL，加入2 g無水硫酸鎂，陶瓷均質(zhì)子，渦旋5 min，放入－18 ℃冷凍5 min，加入10 mL正己烷溶液，渦旋5 min，以4 000 r/min離心3 min，取上層清液2 mL加入弗羅里硅土200 mg、C18100 mg、MgSO4300 mg，具體結(jié)果見圖3。

圖3 硫酸-甲醇體積分?jǐn)?shù)對提取效率的影響Fig. 3 Effect of sulfuric acid concentration mixed with methanol on extraction efficiency

反應(yīng)的溫度和酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對酸催化甲酯化的影響都比較大[27]，本研究的宗旨是快速有效，因此采用提高硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和加無水硫酸鎂來替代加熱，牛奶中含有大量的水分，高體積分?jǐn)?shù)的硫酸-甲醇加入時會放熱，無水硫酸鎂加入時也會放熱，利用這個溫度來催化反應(yīng)的進行。但值得注意的是，需要在離心管中加入陶瓷均質(zhì)子，無水硫酸鎂容易產(chǎn)生結(jié)塊，而陶瓷均質(zhì)子可以打碎結(jié)塊，充分分散基質(zhì)，提高提取效率。實驗結(jié)果表明，在30%硫酸-甲醇水平下各指標(biāo)回收率均相對較好。

2.3 凈化填料的優(yōu)化

常用的凈化劑有PSA、C18、弗羅里硅土、GCB等固相萃取填料，它們分別對有機酸、非極性、極性物質(zhì)、色素等有不同程度的吸附，但前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)PSA對δ-HCH有強烈的吸附，根據(jù)本實驗樣品及目標(biāo)物質(zhì)的特性，最終選用C18、弗羅里硅土為凈化劑。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，無水硫酸鎂的脫水效果比無水硫酸鈉強[28]，本實驗中選用無水硫酸鎂為脫水劑。在5 μg/kg加標(biāo)水平下，以2 mL提取液為研究對象，對凈化條件進行優(yōu)化。

2.3.1 C18用量的選擇

實驗固定弗羅里硅土用量為200 mg，MgSO4用量為300 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（150 mg）、D（200 mg）、E（250 mg）、F（300 mg）C18。結(jié)果表明，大部分指標(biāo)的回收率隨著C18用量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的狀態(tài)，并在C18為150 mg時達(dá)到最大值。C18主要在去除非極性雜質(zhì)方面效果良好[29]，而有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯屬于非極性較強的化合物，C18用量過大，吸附完雜質(zhì)，過多的C18會對目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附，因此，最終選用C18用量為150 mg，結(jié)果見圖4。

圖4 C18用量對提取效率的影響Fig. 4 Effect of C18 dosage on extraction efficiency

2.3.2 MgSO4用量的選擇

實驗固定弗羅里硅土用量為200 mg，C18用量為150 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（200 mg）、D（300 mg）、E（400 mg）、F（500 mg）MgSO4。此處MgSO4的作用仍然是去除提取液中的水分，進樣溶液中如果水分含量高對儀器和柱子有損耗，也會降低柱效，影響實驗結(jié)果。實驗結(jié)果表明，MgSO4用量為200 mg時，各組分平均回收率最高（圖5）。

圖5 MgSO4用量對提取效率的影響Fig. 5 Effect of MgSO4 dosage on extraction efficiency

2.3.3 弗羅里硅土用量的選擇

實驗固定MgSO4用量為200 mg，C18用量為150 mg，取2 mL提取液6 份，分別加入A（50 mg）、B（100 mg）、C（150 mg）、D（200 mg）、E（250 mg）、F（300 mg）弗羅里硅土。弗羅里硅土對極性干擾的吸附有很好的作用[30]，實驗發(fā)現(xiàn)，隨著弗羅里硅土用量的增加，各指標(biāo)的回收率有的呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，有的指標(biāo)變化不大，綜合各指標(biāo)平均回收率和經(jīng)濟因素，最終選用弗羅里硅土為50 mg，結(jié)果見圖6。

圖6 弗羅里硅土用量對提取效率的影響Fig. 6 Effect of Florisil dosage on extraction efficiency

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察結(jié)果

基質(zhì)效應(yīng)是殘留檢測中普遍存在的現(xiàn)象，會對分析方法的重復(fù)性、靈敏度、準(zhǔn)確度等產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率[29]，基質(zhì)效應(yīng)越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小，反之亦然，結(jié)果見表2。

表2 線性方程和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations and matrix effect ratio

由表2可以看出，pp’-DDT、op’-DDT、γ-HCH、β-HCH的基質(zhì)效應(yīng)較大，7 種多氯聯(lián)苯相對基質(zhì)效應(yīng)影響相對較小，實驗中可以采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線、加入分析保護劑、鹽析等降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。本實驗中采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線降低基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 檢出限、回收率、精密度實驗結(jié)果

實驗以3 倍信噪比計算檢出限。方法的準(zhǔn)確度用回收率表示，添加量分別為0.5、5.0、50.0 μg/kg，每個添加水平重復(fù)測定6 次。方法的精密度用6 次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示。表3表明，目標(biāo)成分檢出限為0.1～0.3 μg/kg，加標(biāo)回收率范圍為85.5%～115.2%，RSD為3.5%～9.8%（n=6），低于10%。

表3 樣品的檢出限、平均回收率和RSDTable 3 LODs, average recoveries and RSDs of the method

3 結(jié) 論

本實驗通過對前處理方式、常用凈化劑的種類和用量等進行選擇和優(yōu)化，建立了快速測定牛奶中有機氯及多氯聯(lián)苯殘留量的GC-MS/MS分析方法。方法簡單、快速、凈化效果好、靈敏度高、重復(fù)性好，可滿足牛奶中有機氯及多氯聯(lián)苯殘留量的快速篩查和定量分析要求。

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