UPLC結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選正骨洗藥最佳水煎工藝

董逸凡，吳婷婷，張 蕊，許保海*

0 引言

正骨洗藥是北京積水潭醫(yī)院六十年代中醫(yī)科主任佟闊泉主任醫(yī)師(清末御醫(yī))的經(jīng)驗(yàn)方。由川芎、乳香、白芷、赤芍、秦艽、續(xù)斷、羌活、透骨草、降香、紅花、沒藥、當(dāng)歸、蘇木、木瓜、川牛膝、獨(dú)活、威靈仙17味中藥粉碎過篩后分裝至濾紙袋，制成每袋20 g。具有活血消腫、散風(fēng)祛濕的功效。用于跌打瘀血、筋骨諸痛、風(fēng)寒濕性腰痛、關(guān)節(jié)痛等，臨床療效顯著[1]。使用時(shí)取1袋水煮或開水沖泡后洗患處，每次0.5 h，藥水涼后再熱，反復(fù)數(shù)次，用后保存，每袋可用2 d。方中川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛，為方中君藥，其有效成分阿魏酸有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化作用[2-4]，可劑量依賴性促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，顯著增加ALP的活性、OPG mRNA和OA mRNA的表達(dá)，具有骨形成促進(jìn)效應(yīng)[5]；羌活解表散寒，祛風(fēng)除濕止痛，為方中臣藥，有效成分異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、抗炎抗菌[6]、促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的能力[7]。該藥尚未制定最佳的煎煮標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致患者使用時(shí)，因?yàn)榧逯蠓椒ú煌率顾幰簼舛炔煌M(jìn)而影響療效的問題一直存在。因此，探究正骨洗藥最佳的煎煮方法，制定正骨洗藥的煎煮標(biāo)準(zhǔn)，使其發(fā)揮更好的療效，是一個(gè)亟待解決的重要問題。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海一科儀器有限公司)，KQ3200E型超聲儀(昆山超聲波儀器有限公司)，AG285型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。阿魏酸(批號(hào)：110773-201614)，異歐前胡素(批號(hào)：110827-201611)購于國家食品藥品檢定研究院；正骨洗藥(批號(hào)：161202)；乙腈(HPLC級(jí)，默克公司)；磷酸分析純(北京化工廠)，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 (BEH)C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫：0～2 min,15% A；4～14 min,25%～65% A；14～16 min，65% A；16～17 min，65%～15% A；17～23 min，15% A；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)異歐前胡素254 nm，阿魏酸330 nm；柱溫30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精確稱取阿魏酸、異歐前胡素對(duì)照品適量，用適量甲醇溶解，分別定容至10 mL容量瓶中，搖勻，配制成含有阿魏酸、異歐前胡素濃度為0.193 mg/mL、0.016 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，放入冰箱4 ℃避光保存。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)正骨洗藥自身特點(diǎn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9(34)正交試驗(yàn)法考察煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)、加水量對(duì)正骨洗藥中君藥和臣藥有效成分含量的影響。以正骨洗藥中阿魏酸、異歐前胡素及湯劑浸出物得率為指標(biāo)，其因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.4 供試品溶液的制備 取正骨洗藥1袋，根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)表所列條件進(jìn)行煎煮制成湯劑溶液。精密移取湯劑樣品溶液100 mL，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去水溶液，所得殘?jiān)尤?0%甲醇，超聲提取30 min，提取液4 000 r/min離心10 min，取上清液，80%甲醇定容至10 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

2.5 各指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密移取含有阿魏酸和異歐前胡素的混合對(duì)照品溶液，加入甲醇逐級(jí)稀釋，制成含阿魏酸19.285 4、38.570 8、77.141 6、115.712 4、154.283 2、192.854 μg/mL和異歐前胡素1.632 8、3.265 6、6.531 2、9.796 8、13.062 4、16.328 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣1.0 μL進(jìn)行測(cè)定，分別以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表2。

表2 線性回歸方程

2.5.2 樣品測(cè)定 按色譜條件測(cè)定9組供試品中阿魏酸和異歐前胡素含量，記錄峰面積值，計(jì)算各指標(biāo)成分含量。色譜圖見圖1，阿魏酸和異歐前胡素色譜峰保留時(shí)間分別為：2.486、12.281 min。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

圖1 正骨洗藥UPLC色譜圖

注：A.254 nm混合對(duì)照品，B.330 nm混合對(duì)照品，C.254 nm正骨洗藥，D.330 nm正骨洗藥，E.川芎陰性對(duì)照，F(xiàn).羌活陰性對(duì)照；1.阿魏酸，2.異歐前胡素

2.5.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算阿魏酸、異歐前胡素峰面積的RSD(n=6)分別為0.5%、0.17%。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別取正骨洗藥6份，按“2.4”項(xiàng)下方法各制備6份供試品溶液，按色譜條件進(jìn)樣，阿魏酸平均含量為1.54 mg/g，RSD為1.31%(n=6)；異歐前胡素平均含量為0.124 mg/g，RSD為0.28%(n=6)。

2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知濃度的正骨洗藥，在高、中、低每個(gè)添加水平下，平行制備樣品3份并測(cè)定，阿魏酸、異歐前胡素的平均回收率分別為95.90%、97.10%，RSD分別為1.11%、1.61%。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：k1：“1”水平所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)綜合評(píng)分之和；k2：“2”水平所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)綜合評(píng)分和；k3：“3”水平所對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)綜合評(píng)分和；R：極差

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果阿魏酸、異歐前胡素峰面積的RSD值分別為0.48%、0.34%。

2.6 最佳結(jié)果分析 采用綜合加權(quán)評(píng)分法，分別將阿魏酸、異歐前胡素、浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3、0.2、0.5，3項(xiàng)中最好的指標(biāo)為100分，各個(gè)指標(biāo)的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：綜合評(píng)分=Y1/1.58×0.3×100+Y2/0.126×0.2×100+Y3/33.85×0.5×100。

根據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)，見表4。從表3的極差結(jié)果看出，影響正骨洗藥湯劑質(zhì)量的各因素的主次順序?yàn)镃>A>B。由表4可知，因素A和C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P<0.05)，因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著影響(P>0.05)。經(jīng)過綜合分析，正骨洗藥的最佳水煎工藝為A2B1C2，即煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。

表4 方差分析

2.7 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 取3份正骨洗藥，在最佳煎煮工藝的條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得浸出物平均得率為33.04%±0.87%，湯劑中阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(1.54±0.02)mg/g，異歐前胡素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.124±0.00)mg/g。

3 討論

中藥湯劑是中醫(yī)臨床最常用的劑型之一，湯劑的療效與其煎煮方法有直接關(guān)系。正骨洗藥為我院骨科常用藥，為方便患者沖泡或煎煮使用，制成粉碎程度適中的藥材粗粉。相比中藥傳統(tǒng)飲片，中藥“煮散”具有煎出率高、節(jié)省藥材、煎煮時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[8]，故正骨洗藥不適于按照傳統(tǒng)飲片煎煮經(jīng)驗(yàn)煎煮。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)正骨洗藥自身特點(diǎn)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素水平，取君藥、臣藥有效成分和浸出物得率為考察指標(biāo)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]摸索實(shí)驗(yàn)條件，得到正骨洗藥最佳水煎工藝為煎煮30 min，煎煮1次，加20倍水。該煎煮方法穩(wěn)定可靠，可有效控制正骨洗藥的質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC同時(shí)測(cè)定了正骨洗藥2種有效成分，實(shí)驗(yàn)精密度、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，此方法簡(jiǎn)便快捷，穩(wěn)定可行，為臨床上更合理地使用正骨洗藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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