抑制豬支持細胞外泌體對精原干細胞自我更新及分化的影響

田海瑞,汪晶晶,李曉曉,張丹琛,鄒康

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)干細胞研究與轉(zhuǎn)化中心/動物科技學(xué)院生殖干細胞與微環(huán)境實驗室,江蘇 南京 210095)

豬因在解剖學(xué)和生理學(xué)與人類高度相似,如飲食、肥胖傾向、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和有氧運動的血液循環(huán)系統(tǒng)[1],經(jīng)常被用作動物模型進行生理和藥理學(xué)研究。因公豬連續(xù)產(chǎn)生大量配子的必要性,人們對精子發(fā)生提出了更高的要求:在整個生命周期,需要一個活躍的干細胞群,以高水平的組織協(xié)調(diào)來確保精子的持續(xù)供應(yīng)。這個干細胞群為精原干細胞群(spermatogonial stem cells,SSC):通過自我更新維持自身細胞數(shù)目的平衡,以及分化產(chǎn)生不同等級的精原細胞、精母細胞和精細胞。一般認為分化程度最低的精原細胞即 Asingle(As)型精原細胞為SSC,在曲細精管的基底膜上以單個細胞的形式存在。SSC在轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)和建立豬再生醫(yī)學(xué)模型方面具有重要價值,然而由于其數(shù)量少及體外無法長期培養(yǎng),導(dǎo)致豬精原干細胞(pSSC)的研究和應(yīng)用受到了極大阻礙。pSSC在不同飼養(yǎng)層上培養(yǎng),生長狀態(tài)不同,大多研究將支持細胞作為飼養(yǎng)層細胞。在哺乳動物體內(nèi),支持細胞是SSC微環(huán)境的重要組成部分,在維持SSC自我更新和分化平衡及睪丸穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。支持細胞會產(chǎn)生膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF)和成纖維細胞因子2(fibroblast growth factor,FGF2),對維持SSC的存活和自我更新至關(guān)重要[2-3];此外,支持細胞產(chǎn)生的干細胞因子(stem cell factor,SCF)、維甲酸(retinoic acid,RA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)也可以誘導(dǎo)精原細胞分化。因此,支持細胞分泌的調(diào)控因子是影響精原干細胞命運的一種重要物質(zhì)。

外泌體是直徑為30～150 nm的細胞外囊泡,被脂質(zhì)雙分子層包裹各種生物分子,包括蛋白質(zhì)、聚糖、脂質(zhì)、代謝物以及核酸。隨著對外泌體的深入研究,其在細胞間的通訊作用受到廣泛關(guān)注,包括免疫應(yīng)答、蛋白核酸轉(zhuǎn)移[4]、衰老[5]、增殖分化[6]等。例如:外泌體攜帶的miRNA能夠協(xié)調(diào)腫瘤代謝微環(huán)境,可作為腫瘤診斷的標記物,甚至外泌體“物質(zhì)傳遞”的特性可以用于腫瘤治療[7];癌細胞來源的外泌體可以將信息傳遞給基質(zhì)成纖維細胞,促使其分化為肌成纖維細胞[8];前列腺癌細胞來源的外泌體在局部腫瘤微環(huán)境的細胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用,可顯著減少正常細胞凋亡、增加癌細胞增殖并誘導(dǎo)癌細胞遷移[9]。外泌體在雄性生殖系統(tǒng)也發(fā)揮生物學(xué)功能,前列腺體將膜成分以及遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到精子,增加精子活力,同時避免過早獲能和自發(fā)的頂體反應(yīng),保護精子免受女性生殖道的免疫反應(yīng)[10]。附睪小體在精漿和精子間的通訊中發(fā)揮作用,能夠改變精子膜的脂質(zhì)組成,從而有助于精子獲得運動潛力和穿透透明帶的能力[11]。此外,外泌體成為治療不孕癥的新嘗試,在受損精子和治療弱精子癥方面發(fā)揮作用。例如:無精癥大鼠注射羊水來源外泌體后,精子發(fā)生改善,恢復(fù)精子參數(shù)(如,運動性、濃度以及精原細胞與精母細胞的數(shù)量),并最終恢復(fù)雄性生育能力[12];犬脂肪間充質(zhì)干細胞來源外泌體對犬精子冷凍損傷以及對解凍后精子參數(shù)的改善發(fā)揮積極作用[13]。然而,有關(guān)外泌體在雄性生殖的研究更多側(cè)重于生殖細胞發(fā)育、精子功能和附睪成熟,對SSC命運的調(diào)控關(guān)注甚少,尤其是外泌體是否能夠調(diào)控豬精原干細胞命運這一問題亟待解答。

為了優(yōu)化豬精原干細胞的體外培養(yǎng)條件,進一步探究影響精原干細胞命運的因素,了解支持細胞對精原干細胞調(diào)控的分子機制,本試驗擬分離豬支持細胞并提取豬支持細胞外泌體,用外泌體抑制劑(GW4869)處理支持細胞,再與pSSC共培養(yǎng),探究支持細胞外泌體對豬精原干細胞命運的影響因素,為優(yōu)化豬精原干細胞體外培養(yǎng)方法及體內(nèi)調(diào)控精子發(fā)生提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗所用的豬睪丸來自7日齡的雄性長白豬。由豬場實驗人員采集睪丸組織,浸泡于含雙抗的PBS中運輸至實驗室。所有動物試驗和程序均經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物保護委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器

倒置顯微鏡購于OLYMPUS公司,超凈工作臺購于蘇凈安泰公司,高速冷凍離心機、CO2培養(yǎng)箱購于Thermo Fisher Scientific公司,超速離心機為貝克曼庫爾特Optima系列;GW4869購于大連美侖生物技術(shù)有限公司,維生素、胎牛血清、膠原酶、非必需氨基酸、胎牛血清、F12/DMEM培養(yǎng)基、胰酶均購于Gibco公司,紅細胞裂解液購于北京索萊寶科技有限公司,巰基乙醇、L-谷氨酰胺和FGF2、GDNF、GFRA1等生長因子購于Sigma公司,青霉素購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,TRNzol Universal試劑購于天根生化科技有限公司。

pSSC培養(yǎng)液:F12/DMEM培養(yǎng)基、10 g·L-1維生素、5×10-5mol·L-1巰基乙醇、10%胎牛血清、5 g·L-1青霉素、10 ng·mL-1FGF2、10 ng·mL-1GDNF、10 ng·mL-1GFRA1。

支持細胞培養(yǎng)液:F12/DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、0.5%青霉素、1%非必需氨基酸、5×10-5mol·L-1巰基乙醇。

1.3 豬精原干細胞和支持細胞的分離

在不破壞睪丸表面膜結(jié)構(gòu)的情況下,將睪丸外周附睪、脂肪等組織剝離,去除表面白膜和中心白色結(jié)締組織后用眼科剪將組織剪碎,加入膠原酶吹散后放入CO2培養(yǎng)箱中37 ℃消化。每隔10 min取出重新吹散,消化至無組織團塊,總時間約30 min。加入紅細胞裂解液,4 ℃處理15 min。離心后加入胰酶消化5 min,用10% FBS終止消化,離心,得到睪丸總細胞。

分離精原干細胞:將睪丸總細胞用支持細胞培養(yǎng)液重懸,分別在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)15 min、30 min、2 h進行差異貼壁,離心,將培養(yǎng)液換成pSSC培養(yǎng)液后培養(yǎng)過夜。次日鋪到絲裂霉素處理好的支持細胞上繼續(xù)培養(yǎng)。

分離支持細胞:將睪丸總細胞用支持細胞培養(yǎng)液重懸,在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h后吸去上清液并去除未貼壁的雜細胞,換培養(yǎng)液過夜培養(yǎng)后進行低滲處理,得到純化的支持細胞。

1.4 外泌體的提取

體外培養(yǎng)的支持細胞在培養(yǎng)密度接近60%～70%時,將支持細胞培養(yǎng)液更換為無血清培養(yǎng)液,培養(yǎng) 48 h 后收集細胞上清液,采用差速離心法提取外泌體。具體方法:300g離心10 min,去除細胞;2 000g離心10 min,去除死細胞;10 000g離心30 min,去除細胞碎片;120 000g離心90 min,得到沉淀即為外泌體,再用PBS重懸、漂洗,120 000g再離心90 min,得到外泌體沉淀。

1.5 支持細胞外泌體分泌的抑制

GW4869母液的配制:將5 mg GW4869加入158 μL二甲基亞砜(DMSO),配制成100 mmol·L-1GW4869母液,避光-80 ℃保存。

支持細胞外泌體的分泌抑制:用無血清培養(yǎng)液分別配制5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869。將支持細胞接種到60 mm或者100 mm培養(yǎng)皿中,放入CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),當細胞密度大概鋪滿培養(yǎng)皿底部約60%時,去除培養(yǎng)液后用D-Hanks洗3次。分別加入5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869,CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。

比較2組患者治療前治療后3月及6月時腫瘤體積;比較2組患者治療前、治療后12月時的甲胎蛋白(AFP)水平，2組患者術(shù)后并發(fā)癥、治療后3月時的腫瘤完全壞死率及治療后1、2及3年生存率。腫瘤體積以CT測量為準，V=πabc/6 cm3(V為體積，a、b、c 為腫瘤的長、寬、高)，于治療前、治療后12月時，采集患者空腹靜脈血，分離血清，采用電化學(xué)發(fā)光法測定AFP水平。

1.6 RNA 提取、cDNA合成和逆轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)

采用 Trizol法提取睪丸組織及細胞樣品總RNA。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)合成 cDNA。參照試劑盒說明進行RT-PCR反應(yīng),以GAPDH為內(nèi)參,用ddH2O作陰性對照。本試驗所用引物序列見表1。

表1 試驗所用引物序列Table 1 The primer sequences used in the experiment

1.7 睪丸組織、外泌體和細胞蛋白的提取及Western Blot 分析

將睪丸組織、細胞或外泌體加入配制好的 Ripa 裂解液(含 5 g·L-1的 PMSF 和 DTT),置于搖床上,冰浴裂解15 min。用無菌1.5 mL EP管收集樣品并加入蛋白變性緩沖液進行蛋白變性。取出配制好的蛋白免疫印跡凝膠,上樣后80 V 電泳20 min后調(diào)整電壓為120 V,根據(jù)試驗所需進行電泳時間的控制。電泳結(jié)束后根據(jù)試驗需要切膠,裁剪適當大小的PVDF膜和濾紙,按照負極-纖維墊-濾紙-膠-膜-濾紙-纖維墊-正極的組裝方式組裝,然后進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜用TBST 洗滌1 min,轉(zhuǎn)入5%脫脂奶粉,室溫封閉1～2 h。加一抗(根據(jù)試驗需要選擇稀釋比例)孵育,4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次后加二抗(1∶5 000 稀釋)并室溫孵育1 h,TBST 洗膜3次,暗室中加入 ECL 顯示免疫條帶,用膠片按壓曝光條帶?？贵w信息見表2。

表2 所用抗體信息Table 2 Detail of antibodies

1.8 免疫熒光檢測支持細胞、pSSC及外泌體

將支持細胞或pSSC鋪到96孔板,在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),免疫熒光檢測時將培養(yǎng)液去除,用PBS清洗2～3次。用卡諾固定液-20 ℃固定20 min;免疫熒光檢測外泌體存在時用4%中性福爾馬林對支持細胞進行固定,室溫條件放置15 min;去除固定液,用PBS洗2～3次。用10% 的山羊血清37 ℃封閉 30 min;一抗(支持細胞特異性標記物WT1和ITGB1,SSC特異性標記物PLZF和DDX4,外泌體特異性標記物HSP70)用含1%山羊血清的PBS按1∶200進行配制,隨后用其孵育細胞,并將96孔板放入濕盒中,4 ℃冰箱中過夜。PBS洗3 次后避光加入二抗(用含1%山羊血清的PBS按1∶500進行配制)37 ℃孵育 60 min;PBS洗3次后避光加入hoechst33342(1∶500),37 ℃孵育15 min,PBS洗3次后加入抗淬滅劑,置于濕盒中,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 豬支持細胞的分離與鑒定

如圖1-A所示,7日齡仔豬睪丸經(jīng)過兩步酶消化以及低滲純化處理后得到支持細胞。低滲處理時,細胞并未完全伸展開,呈現(xiàn)不規(guī)則狀,再培養(yǎng)1 d后,細胞完全伸展,形態(tài)多為規(guī)則的梭形。

圖1 豬支持細胞的分離純化培養(yǎng)以及鑒定Fig.1 Isolation,purification,culture and identification of porcine Sertoli cells(SC)A.支持細胞分離純化與培養(yǎng)Isolation,purification and culture of Sertoli cells(SC);B. 免疫熒光檢測支持細胞特異性標記物WT1、ITGB1(100×)Immunofluorescence detection of Sertoli cells markers WT1,ITGB1(100×);C. 細胞WT1和ITGB1陽性率統(tǒng)計Analysis of the positive rate of WT1 and ITGB1,respectively;D.RT-PCR檢測支持細胞特異性標記物WT1、AR、ITGB1、SOX9 RT-PCR detection of Sertoli cells markers WT1,AR,ITGB1,SOX9.

通過IF對分離得到的支持細胞進行了純度分析,如圖1-B。用支持細胞特異性標記物WT1和ITGB1進行標記,WT1陽性細胞率達到(87.1±0.02)%,ITGB1陽性細胞率達到(94.2±0.01)%(圖1-C);同時,RT-PCR結(jié)果顯示分離的細胞表達支持細胞特異性標記物WT1、AR、ITBG1、SOX9基因(圖1-D)。以上結(jié)果表明高效分離并純化了豬的支持細胞。

2.2 豬支持細胞外泌體的鑒定

研究表明,如果細胞具有質(zhì)膜的離散區(qū)域,這些區(qū)域富含外泌體和內(nèi)體蛋白,可以作為外泌體生物發(fā)生位點[14],這個位點可以通過免疫熒光檢測。因此,我們將分離得到的支持細胞經(jīng)過中性福爾馬林固定,不進行透膜處理,用外泌體標記蛋白TSG101標記。結(jié)果發(fā)現(xiàn)支持細胞膜表面有明顯的 TSG101信號堆積(圖2-A)。

圖2 豬支持細胞外泌體免疫熒光(A)和Western blot(B)檢測結(jié)果Fig.2 Immunofluorescence(A)and Western blot(B)detection of exosomes secreted by porcine Sertoli cells(SC)黃色箭頭標識TSG101陽性信號。Yellow arrows identify positive signals for TSG101.

為進一步驗證支持細胞分泌外泌體,利用Western blot技術(shù)檢測到了外泌體標記蛋白TSG101、ALIX、HSP70的表達(圖2-B)。以上結(jié)果均證明豬支持細胞分泌外泌體。

2.3 精原干細胞的分離與鑒定

如圖3-A所示,pSSC在培養(yǎng)前期以單細胞為主,細胞邊界明顯,呈規(guī)則的圓形。在培養(yǎng)5～6 d后,pSSC會形成葡萄狀的細胞克隆,但單個細胞仍保持清晰的邊界,且為規(guī)則的圓形。如圖3-B所示,免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),pSSC表達豬精原干細胞特異性蛋白DDX4和PLZF。統(tǒng)計顯示PLZF陽性細胞率為(80.6±0.02)%(圖3-C)。另外RT-PCR結(jié)果也表明pSSC有表達豬精原干細胞特異性標記物THY1、PLZF、DDX4、KIT基因mRNA(圖3-D)。以上均證明分離得到的細胞為純度較高的豬精原干細胞。

2.4 GW4869抑制支持細胞外泌體分泌

GW4869是膜中性鞘磷脂酶(N-SMase2)的非競爭性抑制劑,可保護細胞免受神經(jīng)酰胺積累介導(dǎo)的凋亡。由于N-SMase2對外泌體的分泌至關(guān)重要,GW4869可作為外泌體的抑制劑。為確定GW4869合適濃度,防止GW4869濃度過大導(dǎo)致細胞死亡而影響外泌體的分泌,根據(jù)之前報道[15-17],本試驗分別選用了5、10、20、50和100 μmol·L-1GW4869處理豬支持細胞,結(jié)果如圖4-A所示。5、10、20 μmol·L-1GW4869處理細胞后,細胞并沒有發(fā)生明顯變化,但50和100 μmol·L-1GW4869處理細胞后,細胞表面出現(xiàn)很多點狀斑點,細胞狀態(tài)出現(xiàn)明顯損傷現(xiàn)象,且細胞死亡量增多,最終選擇了20 μmol·L-1GW4869。

另外,為檢測20 μmol·L-1GW4869對豬支持細胞外泌體的抑制情況,將20 μmol·L-1GW4869處理的支持細胞作為試驗組,無處理的支持細胞為對照組,處理48 h后提取外泌體,通過Western blot檢測分析 2組細胞外泌體的分泌情況,結(jié)果如圖4-B所示。與對照組相比,試驗組的外泌體TSG101、HSP70、ALIX表達量均下降。以上結(jié)果表明20 μmol·L-1GW4869可以有效抑制支持細胞外泌體的分泌。

2.5 支持細胞外泌體影響pSSC自我更新及分化

用20 μmol·L-1GW4869處理支持細胞48 h,去除 GW4869后作為飼養(yǎng)層與pSSC進行共培養(yǎng)。如圖5-A 所示:與對照組相比,處理組的pSSC在共培養(yǎng)1 d時部分細胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài);共培養(yǎng)3 d后試驗組pSSC狀態(tài)變差,大多細胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài),且較對照組不貼壁的細胞克隆變多。收集共培養(yǎng)3 d的細胞,提取RNA,通過RT-PCR檢測pSSC的標志基因表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pSSC中PLZF基因表達顯著升高;KIT、THY1、DDX4基因表達水平顯著降低(圖5-B、C)。此外,收集細胞蛋白,利用Western blot技術(shù)檢測了豬精原干細胞PGP9.5和DDX4蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在處理組支持細胞上共培養(yǎng)的pSSC,PGP9.5蛋白表達水平顯著升高,DDX4蛋白表達顯著下降,與RT-PCR結(jié)果一致(圖5-D、E)。上述結(jié)果表明,體外培養(yǎng)抑制支持細胞外泌體的分泌,pSSC分化能力受到抑制,細胞趨向自我更新方向發(fā)展,支持細胞分泌的外泌體傾向于促進pSSC的分化。

圖5 利用支持細胞-pSSC共培養(yǎng)模型檢測外泌體對pSSC的影響Fig.5 Detection of the function of exosomes on pSSC using Sertoli cells-pSSC co-culture modelA. pSSC與支持細胞共培養(yǎng)(黃色箭頭標識不貼壁的細胞)pSSC co-culture with Sertoli cells(yellow arrows identify non-adherent cells);B、C. RT-PCR檢測pSSC標志基因的表達RT-PCR detection of the expression of pSSC marker gene;D、E. Western blot檢測pSSC標志蛋白的表達Western blot detection of the expression of pSSC marker protein. *P<0.05,**P<0.01.

3 討論

與嚙齒動物相比,對畜禽的精原干細胞研究較少,未分化的豬精原細胞或pSSC的特異性標記物尚不明確。目前關(guān)于嚙齒動物精原細胞不同階段的分子標志物研究較為清晰,如:PLZF蛋白在 Asingle(As)、Apaired(Apr)和 Aaligned(Aal)精原細胞中表達,缺乏PLZF的小鼠精原細胞會隨著年齡增長逐漸喪失,但不會有明顯分化缺陷或支持細胞的喪失[18];KIT蛋白在 As、Apr和早期 Aal精原細胞中表達量較低或者并不表達,而在Aal和進一步分化的精原細胞中表達較強[19];THY1蛋白已被確定為嚙齒動物和非人靈長類動物中的保守精原干細胞標志物,幾乎所有THY1+細胞都是PLZF+和KIT-[20]。pSSC的一些特定生物標志物已被鑒定,例如PGP9.5、PLZF、同源結(jié)構(gòu)蛋白(nanog homeobox,NANOG)和階段特異性胚胎抗原1(stage-specific embryonic antigen 1,SSEA1)。DDX4是包括豬[21]在內(nèi)的多個物種生殖細胞的特異性蛋白標志物,被廣泛用于生殖細胞的鑒定。本試驗RT-PCR檢測結(jié)果證明當豬支持細胞外泌體受到抑制時,pSSC表現(xiàn)為THY1、KIT表達水平降低,PLZF表達水平升高;Western blot檢測結(jié)果顯示PGP9.5蛋白表達水平升高,表明支持細胞外泌體受到抑制時,pSSC狀態(tài)發(fā)生變化,其分化能力受到抑制,細胞向自我更新方向發(fā)展。抑制豬支持細胞的外泌體分泌導(dǎo)致pSSC的狀態(tài)變差,部分細胞呈現(xiàn)不透亮狀態(tài),并伴隨DDX4基因的表達水平降低。這一現(xiàn)象可能是GW4869破壞了外泌體對pSSC分化狀態(tài)的調(diào)控作用造成的,即已啟動分化的精原細胞在外泌體被抑制后無法繼續(xù)分化,導(dǎo)致這些細胞失去了自我更新的能力,因此發(fā)生了凋亡,但這還需更多的試驗驗證。另外,是否可以利用支持細胞外泌體優(yōu)化pSSC體外培養(yǎng)條件以實現(xiàn)pSSC的長期培養(yǎng),值得進一步探究。

我們推測外泌體受到抑制引起pSSC變化與豬支持細胞有關(guān)。豬支持細胞和鼠支持細胞一樣也可以產(chǎn)生一些可溶性因子,在出生前維持性原細胞和出生后調(diào)控精原干細胞命運至關(guān)重要。如支持細胞會分泌膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glia cell-derived neurotrophic factor,GDNF),過度表達 GDNF 小鼠會導(dǎo)致未分化精原細胞的積累,即GDNF 有助于精原細胞自我更新和分化的旁分泌調(diào)節(jié)[22]。此外,有研究表明pSSC體外培養(yǎng)需要 GDNF 以外的外在因素來促進增殖[23],如在新生大鼠睪丸細胞的培養(yǎng)液中加入纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)對生殖細胞增殖具有積極作用。對在體外培養(yǎng)pSSC的研究中發(fā)現(xiàn),在pSSC培養(yǎng)液中加入表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)對 pSSC細胞克隆的形成有很大影響。在EGF存在的情況下,細胞克隆數(shù)量和覆蓋總面積增加[24]。由于目前對支持細胞外泌體成分以及外泌體如何影響pSSC命運尚未可知,因此需要進一步對其進行成分分析,確定其中發(fā)揮生物功能的成分并進一步探究其分子機制。

外泌體在調(diào)節(jié)正常生命活動和疾病診斷治療方面具有獨特的生物學(xué)功能。首先體外注射外泌體抑制劑有利于疾病的治療,例如腹腔注射GW4869減少了小鼠敗血癥引起的心臟炎癥[25],GW4869通過阻止外泌體分泌可以減少體內(nèi)淀粉樣蛋白斑塊的形成,這有利于阿爾茨海默病的治療[26]。此外,通過外泌體靶向藥物遞送系統(tǒng)也有助于疾病的治療,例如通過基因工程改造的外泌體可用于治療乳腺癌[27],通過siRNA電穿孔改造的外泌體可用于治療胰腺癌[28]。本試驗結(jié)果顯示豬支持細胞影響pSSC自我更新及分化,這為改善種公豬生殖力研究提供了新思路,未來可以利用GW4869或外泌體靶向注射,維持pSSC自我更新及分化,保證精子發(fā)生的有序進行,這對治療公豬無精癥、提高種公豬生殖力以及延長種公豬繁殖周期有重要作用。

綜上,豬支持細胞分泌外泌體且受20 μmol·L-1GW4869的抑制,pSSC分化能力也受到抑制,細胞趨向自我更新方向發(fā)展;暗示外泌體是支持細胞調(diào)控精原干細胞狀態(tài)的一種重要方式。本試驗結(jié)果為進一步探索豬支持細胞對精原干細胞的調(diào)控機制提供了新思路,為改善種公豬繁育力提供了新方式,也為治療雄性動物以及人類生殖疾病提供重要參考。