育雛溫度對雛雞卵黃囊脂肪酸吸收和腸道發(fā)育及代謝相關基因GLUT2和PepT1表達的影響

趙羽彤,陳興勇,劉政權,常鵬輝,彭錦州,吉倩昀

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省級實驗室,安徽 合肥 230036)

雛雞出殼后在營養(yǎng)上經(jīng)歷了由完全依靠內源性養(yǎng)分(卵黃囊)到依賴外源性飼料養(yǎng)分的轉折,并將未吸收的卵黃囊從蛋腔中轉入腹腔中作為暫時的營養(yǎng)來源[1]。良好的卵黃囊吸收效果可維持其早期生命力和后期生長發(fā)育[2]。卵黃免疫球蛋白IgY,又稱卵黃抗體,能有效地填補雛禽自身建立免疫機能的空檔期,刺激雛雞腸道生長發(fā)育及免疫機能的建立[3]。卵黃囊中IgY隨其他營養(yǎng)物質一起進入雛雞體內,至 7日齡左右卵黃抗體(IgY)由雛雞自身產(chǎn)生的抗體IgA取代,雛雞逐漸建立自身免疫力[4]。因此,卵黃囊吸收效果直接影響雛雞免疫水平。

常規(guī)育雛初始溫度為32～35 ℃,以后每周降低2～3 ℃,至5～6周齡時溫度降至20 ℃左右[5]。在出雛初期,雛雞自身產(chǎn)生的熱量并不能根據(jù)環(huán)境溫度變化調節(jié),因此,環(huán)境溫度對雛雞早期生長至關重要[6]。初生雛雞需經(jīng)歷一系列后處理,包括性別鑒定、免疫注射和運輸,最終進入育雛舍內,并被提供其良好的環(huán)境溫度。因此,初生早期,環(huán)境溫度不高會影響雛雞卵黃吸收和腸道健康[7]。研究表明,雛雞運輸過程的低溫環(huán)境是導致其7日齡死亡率增加的關鍵因素之一,且第1周20 ℃育雛溫度導致雛雞體重顯著降低[8]。初生雛雞卵黃囊吸收依靠一定的育雛溫度,早期較低的育雛溫度是否通過降低卵黃囊吸收進而導致雛雞健康下降尚不得知。

卵黃囊在腸道的吸收效果直接決定腸道發(fā)育健康。腸道是家禽最重要的消化器官,主要負責食物的消化和氨基酸、碳水化合物等營養(yǎng)物質的吸收,對提高機體飼料效率有重要意義[9]。家禽通過腸黏膜吸收的營養(yǎng)物質主要為糖類、脂肪和蛋白質,而單糖直接吸收是雞獲得糖類的主要途徑[2]。GLUT2屬于GLUT家族,在腸上皮細胞的基底外側膜上能夠將單糖運輸出細胞進入血液,滿足孵化后早期生長對營養(yǎng)物質的需求[10]。此外,GLUT2在葡萄糖重吸收過程中也起到重要作用[11]。蛋白質分子質量大,機體不能直接分解吸收,需要被分解為小肽以供機體吸收,PepT1是質子偶聯(lián)寡肽轉運蛋白家族的成員之一,膳食氨基酸可以通過肽轉運蛋白Pept1的作用作為二肽和三肽運輸?shù)侥c上皮細胞中[12]。腸道對營養(yǎng)物質的吸收可通過腸絨毛長度、隱窩深度和絨隱比來反映,較長的絨毛長度和較小的隱窩深度說明腸道上皮細胞成熟度高,消化酶的合成和分泌加快,腸道消化功能增強[13]。

為了探究初生雛雞早期較低的育雛溫度是否影響卵黃吸收及腸道發(fā)育,本試驗以世界公約組織收錄的淮南麻黃雞為對象,比較早期不同育雛溫度對卵黃囊吸收、免疫球蛋白水平、腸道發(fā)育以及消化相關基因表達水平的影響,為初生雛雞后處理環(huán)境溫度提供指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與樣本采集

選取1日齡淮南麻黃雞雛雞189只(淮南市興楊食品有限公司),隨機均分為3組,育雛溫度分別為33、30和27 ℃,每組3個重復,每個重復21只,2.5 d后統(tǒng)一育雛溫度為33 ℃。飼料營養(yǎng)水平按照美國國家研究委員會(NRC)[14]標準進行,粗蛋白20%、粗纖維2.6%、鈣1%、磷(可利用磷)0.45%、鈉0.18%、賴氨酸1.08%、蛋氨酸0.45%、含硫氨酸(蛋氨酸+胱氨酸)0.77%、蘇氨酸0.65%,以上均為質量分數(shù)。

育雛期內分別于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、7.0和14.0日齡從每個重復中取3只雛雞,記錄屠宰前活重;心臟采血,分離血清,用于抗體分析;屠宰記錄法氏囊、脾臟和卵黃囊重;收集卵黃囊液于-20 ℃保存,用于脂肪酸組成和含量分析,只取前2.5 d卵黃囊樣品用于分析;取小腸各段的中間部位,4%多聚甲醛固定,用于腸道結構分析;取小腸各段中間部位,-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 脂肪酸測定

卵黃囊脂肪酸測定參照文獻[15]的方法并進行適當修改。將0.6 g卵黃囊中卵黃組織轉移至10 mL離心管,加入0.66 mL C11∶0內標(5 mg·mL-1)、0.66 mL 95%乙醇和1.33 mL純水,于全自動樣品快速研磨儀中55 Hz研磨3 min。轉移混合物至含33 mg焦性沒食子酸、33 mg沸石和3.3 mL鹽酸(8.3 mol·L-1)燒瓶中。75 ℃水浴孵育40 min,加入3 mL 95%乙醇、10 mL乙醚和石油醚同體積混合物。振搖5 min后轉移至分液漏斗中靜置5 min,收集醚層提取液。重復上述步驟3次,將提取液轉移至旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干,殘留物即為脂肪提取物。加入1.6 mL 2% NaOH-甲醇溶液,80 ℃水浴孵化3 min。加入1.4 mL 150 g·L-1三氟化硼甲醇溶液,繼續(xù)80 ℃水浴孵化3 min。待燒瓶冷卻至室溫后加入2 mL正庚烷,振蕩5 min,再加入3 mL飽和氯化鈉水溶液,靜置5 min。吸取上層正庚烷提取液1.5 mL至含有0.6 g無水硫酸鈉的離心管中,振蕩1 min并靜置5 min后吸取1 mL上清液,經(jīng)0.22 μm有機相濾器過濾后至進樣瓶中待測定。樣品用安捷倫7890A氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司)進行分析,色譜柱為DEGS毛細管柱(DB-WAX,30 m×0.25 mm×0.25 mm)。柱溫箱參數(shù):初始柱溫60 ℃,保持2 min后以15 ℃·min-1升高至200 ℃,然后以3 ℃·min-1升高至230 ℃,保持19 min。載氣為高純氮氣,流速為0.8 mL·min-1。進樣口和檢測器溫度240 ℃,進樣體積1 μL,分流比10∶1。使用37種脂肪酸甲酯標準品(CDAA-252795,上海安譜實驗科技有限公司)定性脂肪酸。使用C11為內標,通過公式計算各脂肪酸含量,同時計算飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)和總脂肪酸(TFA)含量。

1.3 免疫器官指數(shù)計算及免疫球蛋白檢測

屠宰后分離免疫器官,稱重,計算器官指數(shù)。計算公式:器官指數(shù)=器官重/活體重。

使用免疫球蛋白試劑盒(SU-B60107、SU-B60110、SU-B60340、SU-B60105,泉州市睿信生物科技有限公司),采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測血清中免疫球蛋白IgG、IgM、IgY、IgA的含量。

1.4 腸道切片的HE染色

腸道組織固定后,經(jīng)脫蠟、浸水、染核、分色、藍化、染質、脫水、透明、封片,迅速滴加適量中性樹膠(國藥集團),加蓋玻片后封片,用光學顯微鏡(IX73,Olympus)觀察并拍攝小腸絨毛結構照片,每張切片隨機取6個測量絨毛長度及隱窩深度并記錄數(shù)據(jù)。

1.5 總RNA提取和cDNA合成

小腸各段組織RNA提取:使用Trizol法提取RNA,棄上清液,留下 RNA 沉淀,向離心管中加入 1 mL 75%乙醇(江蘇強盛功能化學股份有限公司),4 ℃、12 000 r·min-1離心 5 min。取沉淀,開蓋干燥 5～10 min。待干燥后加入 30～50 μL DEPC水(D2917391,上海翊圣生物科技有限公司)吹打溶解沉淀,放入-80 ℃冰箱中保存。小腸組織RNA的反轉錄步驟根據(jù)反轉錄試劑盒(11123ES10,上海翊圣生物科技有限公司)進行操作。

1.6 實時定量PCR(qPCR)分析

基因序列查自NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov),根據(jù)所需的雞基因序列,使用 Primer 5.0軟件設計引物,內參為雞GAPDH基因。所有引物由通用生物系統(tǒng)有限公司(安徽)合成。引物序列見表1。小腸十二指腸、空腸、回腸組織的qPCR(25 μL)體系:12.5 μL Trans StartTMTop Green qPCR Supermix(北京全式金生物技術有限公司),上、下游引物各0.5 μL和2 μL cDNA,9.5 μL ddH2O。qPCR步驟:95 ℃ 5 min,40個循環(huán)(95 ℃ 10 s,50 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s),72 ℃延伸5 min,每個樣品重復3次。采用2-ΔΔCT法處理數(shù)據(jù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析,并采用鄧肯氏多重比較法進行0.05水平上的差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 各溫度組間淮南麻黃雞雛雞體重及卵黃囊重的比較分析

如表2所示:育雛2 d內,各溫度組間雛雞體重無顯著差異(P>0.05)。育雛2.5 d后,30 ℃組雛雞體重顯著高于27 ℃組(P<0.05);育雛7 d,30 ℃和33 ℃組雛雞體重顯著高于27 ℃組(P<0.05);育雛14 d,30 ℃組雛雞體重顯著高于33 ℃和27 ℃組(P<0.05)。育雛1.5 d,雛雞卵黃囊重在30 ℃組顯著高于33 ℃組(P<0.05),其他育雛時間各組間卵黃囊重無顯著差異(P>0.05)。

表2 育雛溫度對雛雞體重及卵黃囊重的影響Table 2 Effect of temperature on body and yolk sac weight of chicks

2.2 各育雛溫度組間卵黃囊脂肪酸組成和含量的比較分析

雛雞卵黃囊主要由15種脂肪酸組成(圖1),主要包括C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t,分別占總脂肪酸含量的34.61%、24.37%、16.1%、13.65%,其次是C22∶0、C20∶4n6、C18∶1n9c、C20∶5n3、C16∶1,其含量占總脂肪酸含量的5.3%、1.14%、1.07%、0.56%、0.51%。雛雞卵黃囊內脂肪酸含量在各育雛溫度組間無顯著差異(P>0.05,表3)。

圖1 卵黃囊樣品的GC-MS總離子圖Fig.1 Total ion diagram of yolk sac sample by GC-MSC11∶0為脂肪酸含量測定內標。C11∶0 is the internal standard for determination of fatty acid content.

表3 育雛溫度對總脂肪酸含量的影響Table 3 The effect of brooding temperature on total fatty acid content

2.3 各育雛溫度組間雛雞免疫器官和免疫球蛋白水平的比較分析

2.3.1 雛雞免疫器官指數(shù)分析如表4所示,育雛7日齡,30 ℃組脾臟重顯著高于其他2組(P<0.05),27與33 ℃組間無顯著差異。育雛期間雛雞免疫指數(shù)在各溫度組間無顯著差異(P>0.05)。

表4 育雛溫度對免疫器官重及免疫器官指數(shù)的影響Table 4 Effect of brooding temperature on immune organs weight and immune organ index

2.3.2 雛雞免疫球蛋白含量分析如圖2所示,育雛期間3個溫度組雛雞血清中IgA含量和IgG含量無顯著差異。育雛7 d,30 ℃組IgM含量顯著高于其他2組(P<0.05)。在育雛2 d,30 ℃組IgY含量顯著高于其他2組(P<0.05),育雛7 d,30 ℃組IgY含量顯著高于27 ℃組(P<0.05)。

圖2 育雛溫度對孵化后各日齡雞血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM、IgY)含量的影響Fig.2 Effects of brooding temperature on the content of serum immunoglobulin(IgA,IgG,IgY and IgM)in chicks同一時間點的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。In the same time different letters mean significant difference(P<0.05).The same as follows.

2.4 不同育雛溫度對小腸形態(tài)的影響

2.4.1 十二指腸形態(tài)測量如圖3、圖4所示,育雛2.5 d,30 ℃組腸絨毛長度顯著高于27 ℃組(P<0.05)。育雛1 d,30 ℃組腸隱窩深度顯著高于33 ℃組(P<0.05),育雛2 d和2.5 d時,30 ℃組腸隱窩深度顯著高于27 ℃組(P<0.05)。育雛1 d,33 ℃組腸絨隱比顯著高于其他2組(P<0.05),育雛14 d,30 ℃組和27 ℃組腸絨隱比顯著高于33 ℃組(P<0.05)。

圖3 雛雞小腸各段的HE染色形態(tài)圖Fig.3 HE staining morphology of various segments of the small intestine in chicks

圖4 育雛溫度對十二指腸絨毛長度和隱窩深度的影響Fig.4 Effects of brooding temperature on villi length and crypt depth in duodenum

2.4.2 空腸形態(tài)測量如圖3、圖5所示:育雛7 d,27 ℃組腸絨毛長度顯著高于其他2組(P<0.05);育雛 14 d,30 ℃、27 ℃組腸絨毛長度顯著高于33 ℃組(P<0.05)。育雛1 d和1.5 d,30 ℃組腸隱窩深度顯著高于33 ℃組(P<0.05);育雛14 d,30 ℃組腸隱窩深度顯著低于其他2組(P<0.05)。育雛0.5 d,33 ℃組腸絨隱比顯著高于其他2組(P<0.05);育雛1.5 d,30 ℃組腸絨隱比顯著低于其他2組(P<0.05);育雛7 d,27 ℃組腸絨隱比顯著高于其他2組(P<0.05);育雛14 d,30 ℃組腸絨隱比顯著高于其他2組(P<0.05)。

圖5 育雛溫度對空腸絨毛長度和隱窩深度的影響Fig.5 Effects of brooding temperature on villus length and crypt depth of jejunum

2.4.3 回腸形態(tài)測量如圖3、圖6所示:育雛1.5 d,30、27 ℃組腸絨毛長度顯著高于33 ℃組(P<0.05);育雛2.5 d,33 ℃組腸絨毛長度顯著高于27 ℃組(P<0.05);育雛14 d,27 ℃組腸絨毛長度顯著高于其他 2組(P<0.05)。育雛2 d,30 ℃組腸隱窩深度顯著高于其他 2組(P<0.05);育雛14 d,30、27 ℃組腸隱窩深度顯著高于33 ℃組(P<0.05)。育雛2 d,30 ℃組腸絨隱比顯著低于其他2組(P<0.05);育雛2.5 d,33 ℃組腸絨隱比顯著高于其他2組(P<0.05);育雛14 d,27 ℃組腸絨隱比顯著低于其他2組(P<0.05)。

圖6 育雛溫度對回腸絨毛長度和隱窩深度的影響Fig.6 Effects of brooding temperature on villus length and crypt depth of ileum

2.5 育雛溫度對相關基因相對表達量的影響

如圖7所示,十二指腸中GLUT2表達量在各個時間段無顯著差異(P>0.05)。育雛1.5 d,27 ℃組空腸GLUT2表達量顯著高于其他2組(P<0.05);育雛7 d,33 ℃組顯著高于27 ℃組(P<0.05)。在回腸中,育雛1 d,33和30 ℃組GLUT2表達量顯著高于27 ℃組;育雛2 d,30 ℃組顯著高于27 ℃組;育雛7 d,30 ℃組顯著高于 27 ℃組;育雛14 d,30 ℃組顯著高于其他2組。育雛1、2 d,33 ℃組PepT1表達量顯著高于其他2組(P<0.05);育雛14 d,30和27 ℃組PepT1表達量顯著高于33 ℃組(P<0.05)。育雛1.5 d,27 ℃組空腸PepT1表達量顯著高于其他2組(P<0.05)。育雛1和2 d時,30 ℃組回腸PepT1表達量顯著高于其他2組(P<0.05);育雛14 d,30和27 ℃組均顯著高于33 ℃組(P<0.05)。

圖7 不同育雛溫度下營養(yǎng)吸收相關基因在小腸中的表達量Fig.7 Expression levels of genes related to nutrient uptake in small intestine at different brooding temperatures

3 討論

出雛初期,雛雞自身體溫調節(jié)機能不完善,需要外界環(huán)境溫度維持自身代謝需要。因此,環(huán)境溫度在育雛早期發(fā)揮重要作用[6]。本研究中,33 ℃組卵黃囊吸收效果良好,說明早期1～3日齡高溫育雛有助于卵黃吸收。30 ℃組體重高于27 ℃和33 ℃組,可見,適宜的環(huán)境溫度有助于刺激雛雞采食。低溫環(huán)境下飼養(yǎng)蛋雛鴨,雛鴨的維持需要代謝能均有隨環(huán)境溫度降低而升高的趨勢[16]。低溫時維持需要代謝能增加,刺激采食量,卻無法彌補能量及營養(yǎng)源的不足。本研究中,27 ℃組體重低于30 ℃組,可能因為過低的溫度使雛雞維持需要代謝能增加,雛雞需要增加采食量并消耗能量以維持機體代謝需要。

Sahan等[17]檢測出52周齡和36周齡母雞所產(chǎn)鮮蛋黃中脂肪酸主要為C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t。本研究中卵黃囊中所含主要脂肪酸種類與其一致,且C16∶0、C18∶1n9t、C18∶0、C18∶2n6t分別占總脂肪酸含量的34.61%、24.37%、16.1%、13.65%。3個育雛溫度處理下,雛雞卵黃囊中各脂肪酸含量均無顯著影響,僅卵黃囊重出現(xiàn)顯著差異,說明雛雞生長發(fā)育過程對卵黃囊各組分的營養(yǎng)需求相對一致。

除遺傳因素外,環(huán)境是影響免疫系統(tǒng)發(fā)育的關鍵因素,特別是在發(fā)育早期[18]。免疫器官的發(fā)育情況和功能狀態(tài)可直接決定鳥類的免疫水平[19]。家禽體內淋巴管和淋巴結發(fā)育不全,因此在雛雞的生長發(fā)育過程中,脾臟是重要的免疫器官之一。法氏囊是鳥類獨有的體液免疫器官,在B淋巴細胞分化中起重要作用[20]。本研究主要探究育雛前60 h不同溫度對后期脾臟及法氏囊發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)7日齡時30 ℃組雛雞脾臟重顯著高于其他2組,說明高溫育雛不能促進免疫器官發(fā)育,適宜的育雛溫度有助于免疫器官發(fā)育。

免疫球蛋白可以通過抗原誘導轉化為抗體,作為體液免疫的第一道屏障,在維持動物免疫功能方面起著重要作用[21]。Hamal等[22]檢測了母雞血清、卵黃、蛋清及雛雞血清中的免疫球蛋白含量,發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgY是母體抗體轉移到雛雞血液循環(huán)中的直接指標,預期轉移比例約為30%。本研究中,30 ℃組雛雞免疫球蛋白IgY含量顯著高于其他2個溫度組,因此推測30 ℃組對雛雞卵黃囊中卵黃抗體吸收較好,能獲得更高的免疫水平。

家禽小腸絨毛高度和隱窩深度是評價小腸消化吸收功能的重要指標。小腸絨毛高度越高,與食糜接觸的表面積越大,表明腸道的吸收功能越強[23]。隱窩深度則是反映腸上皮細胞增殖率和成熟度的重要指標[24]。Zhang等[25]在探究雛雞生長期間小腸的發(fā)育情況發(fā)現(xiàn),十二指腸腸絨毛最早增長,且比空腸和回腸的絨毛長度更高,和本研究結果一致,十二指腸絨毛長度比其他2個腸段更長,且育雛溫度30 ℃十二指腸的腸絨毛及腸隱窩顯著高于其他2個溫度組,說明育雛溫度30 ℃對雛雞十二指腸的腸道形態(tài)產(chǎn)生積極影響。腸絨隱比與腸上皮細胞的新陳代謝有關,比值升高表明腸道形態(tài)較好,消化吸收功能增強,比值降低則表明黏膜受損,消化吸收功能降低[26]。14日齡時,30 ℃組雛雞十二指腸空腸絨隱比顯著高于33 ℃組,說明30 ℃組雛雞十二指腸和空腸發(fā)育更好,吸收營養(yǎng)能力更強。與本試驗結果類似,Hammond等[27]將2種近親小鼠在不同溫度下飼養(yǎng),發(fā)現(xiàn)適應低溫環(huán)境的小鼠比適應高溫的小鼠胃腸道發(fā)育更好。

葡萄糖是重要的營養(yǎng)物質,葡萄糖轉運蛋白在哺乳動物細胞葡萄糖攝取和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著至關重要的作用[28]。GLUT2是轉運吸收小腸葡萄糖的2個主要載體之一,在腸上皮細胞基底外側發(fā)揮作用,將葡萄糖和果糖運輸?shù)窖貉h(huán)中[29-30]。腸道中GLUT2的表達直接影響雞腸道糖類營養(yǎng)物質的吸收。本試驗結果表明,溫度對空腸和回腸中GLUT2的表達量有更顯著影響,尤其30 ℃組回腸一直高于27 ℃組,因此推測溫度對卵黃囊吸收效果產(chǎn)生影響,進而影響雛雞回腸營養(yǎng)吸收,且育雛溫度30 ℃對雛雞葡萄吸收的影響一直持續(xù)到雛雞生長后期。張愛華[31]探究肉仔雞腸道中PepT1的表達差異與發(fā)育規(guī)律后發(fā)現(xiàn),雛雞小肽吸收主要部位是十二指腸,回腸作用相對最小。本研究中,十二指腸中PepT1表達量高于空腸,回腸表達量最少,說明溫度會影響PepT1的表達量,但不影響其主要吸收部位。Freeman等[32]在研究PepT1在消化道中的表達情況時也發(fā)現(xiàn),PepT1 mRNA表達量在絨毛下部100～200 μm中迅速增加,在十二指腸和空腸腸細胞中最豐富,回腸上皮水平較低。本研究結果顯示,在育雛期間,溫度對卵黃囊的吸收產(chǎn)生影響,育雛溫度30 ℃對雛雞后期十二指腸及回腸產(chǎn)生積極影響,有助于營養(yǎng)物質吸收。

綜上,育雛早期溫度對雛雞生長發(fā)育有顯著影響,33 ℃育雛有助于前1.5 d卵黃囊吸收,30 ℃育雛有助于雛雞體重增加、小腸形態(tài)發(fā)育、雛雞免疫水平建立及腸道營養(yǎng)吸收相關基因的表達。