圍產(chǎn)期湖羊能量負平衡下添加三丁酸甘油酯對羔羊瘤胃發(fā)酵指標及微生物多樣性的影響

張昕樂,王智博,陳培勇,王遠孝,張艷麗,王鋒,尤佩華,樊懿萱*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院羊業(yè)科學(xué)研究所,江蘇 南京 210095;2.柏斯托化工控股集團,瑞典 馬爾默 20125;3.江蘇波杜農(nóng)牧股份有限公司,江蘇 南京 211800)

在圍產(chǎn)期,母體泌乳和胎兒生長發(fā)育對母羊攝取營養(yǎng)提出了巨大的挑戰(zhàn),胎兒在產(chǎn)前3周對營養(yǎng)物質(zhì)的需求達到最高水平,而這一時期,母羊的干物質(zhì)采食量卻顯著降低10%～30%[1],導(dǎo)致體內(nèi)多種營養(yǎng)素嚴重缺乏,而能量負平衡則是這其中最為嚴重的一種營養(yǎng)應(yīng)激狀態(tài)[2]。因干物質(zhì)采食量不足引發(fā)的能量負平衡,除了采取改善日糧適口性等措施增加采食量外,還可通過增加消化系統(tǒng)對飼料的吸收利用率來緩解。瘤胃在反芻動物的消化系統(tǒng)中扮演著最為重要的角色,其內(nèi)部的微生物菌群結(jié)構(gòu)的相對豐度將直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[3-4]。研究表明,通過改變母羊妊娠至斷奶的飼糧可以使羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5]。Jami等[6]研究表明,出生至斷奶是犢牛瘤胃微生物菌群建立并定型的時期,在斷奶之后其多樣性逐漸趨于穩(wěn)定。瘤胃微生物不同菌群結(jié)構(gòu)會造成羔羊在營養(yǎng)和能量代謝方面的差異,例如在揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)的合成表現(xiàn)上[7]。

三丁酸甘油酯(TB),化學(xué)式為C15H26O6,在脂肪酶的作用下可以分解為丁酸根和甘油。甘油可以被瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,其中大部分是丙酸,而丙酸又是草酰乙酸和葡萄糖的前體[8]。Guo等[9]研究表明,每頭奶牛飼糧中添加37.5 g·d-1三丁酸甘油酯不僅可以提高奶牛的生產(chǎn)性能,還對奶牛的乳房產(chǎn)生積極影響,提升圍產(chǎn)期母畜生產(chǎn)性能將直接對羔羊瘤胃功能產(chǎn)生影響。額外的營養(yǎng)成分可以影響瘤胃核心群落結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生更多的VFA,對促進瘤胃發(fā)育及其功能的優(yōu)化具有積極意義[10]。瘤胃在完全依賴富含纖維的食物之前會發(fā)生復(fù)雜的生理變化[11],早期營養(yǎng)干預(yù)可改變幼齡動物的微生物定殖模式[12-13],即在羔羊斷奶前通過改善母羊營養(yǎng)狀況可以使羔羊瘤胃向積極方向改變。羔羊日糧不同的營養(yǎng)成分會對其瘤胃微生物有影響,母乳補充TB可能會影響羔羊的瘤胃微生物[14]。本試驗通過在能量負平衡下圍產(chǎn)期湖羊的日糧中添加三丁酸甘油酯,間接改善羔羊營養(yǎng)攝入,探索該途徑下羔羊瘤胃發(fā)酵指標及微生物多樣性的變化,為三丁酸甘油酯在湖羊生產(chǎn)方面的進一步應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、試驗設(shè)計和飼養(yǎng)管理

本試驗在啟東瑞鵬牧業(yè)有限公司開展。依據(jù)生產(chǎn)記錄選取20只體況相似、體重為(45±5)kg健康且懷雙羔的產(chǎn)前50 d湖羊,隨機分為2組,分別為能量負平衡(NEB)組和添加三丁酸甘油酯(TB)組。生產(chǎn)的羔羊采用人工定量飼喂對應(yīng)組別母乳,分組為L-NEB和L-TB。正式試驗期從母羊產(chǎn)前40 d至產(chǎn)后42 d,預(yù)期10 d。當(dāng)羔羊42日齡時,分別從每組隨機挑選5只屠宰,采集瘤胃內(nèi)容物,測量其瘤胃發(fā)酵指標,并采用高通量測序技術(shù)分析其瘤胃微生物。試驗羊采用分欄飼養(yǎng),分別飼喂各組對應(yīng)日糧。三丁酸甘油酯樣品由柏斯托化工控股集團提供(福樂酸SR130,水解丁酸含量≥51.4%)。日糧配方如表1所示。TB組按照NRC標準飼喂(2.8 kg·d-1),NEB組母羊的每天飼料量為TB組的75%(2.1 kg·d-1),自由飲水。試驗前對羊舍進行檢疫消毒驅(qū)蟲防疫,保持羊舍通風(fēng)良好,自然光照,提前對羊群進行健康檢查、驅(qū)蟲和健胃。

表1 全價飼料配方及主要營養(yǎng)指標(以干物質(zhì)計)Table 1 Full-price feed formula and main nutritional indexes %

1.2 樣品采集

屠宰前對試驗羊禁食24 h,不禁水。從胴體采集瘤胃內(nèi)容物,測量其瘤胃發(fā)酵指標,并采用高通量測序技術(shù)對其瘤胃微生物進行分析。

1.3 pH值與VFA的測定

采用pH計測定瘤胃液pH值;參照Liu等[15]的方法測定VFA,其中氣相色譜柱測定改為毛細管色譜柱,柱溫120 ℃,汽化溫度180 ℃,采用氫火焰離子化檢測器,檢測溫度180 ℃,載氣為氦氣,壓力為 60 kPa,氫氣壓力為50 kPa。

1.4 生物信息學(xué)分析

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司,采用Omicsmart平臺進行高通量測序。利用雙末端測序的方法構(gòu)建小片段文庫后進行測序。通過對reads拼接過濾,進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類和物種分類分析,將序列相似度大于97%的聚類為同一OTU。同時使用Mothur v.1.30軟件,對樣品α多樣性指數(shù)進行評估,得到稀釋度曲線,Shannon、CHAO、ACE和Simpon指數(shù)用來評估樣品的測序深度、菌群多樣性。使用QIIME軟件進行β多樣性分析,得到β距離箱線圖,再進行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)分析和主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

VFA含量及測序數(shù)據(jù)用Excel 2019進行初步整理,采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果中平均值和標準誤(SE)分欄顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對羔羊瘤胃發(fā)酵指標的影響

如表2所示,圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后,42日齡羔羊瘤胃pH值無顯著變化,乙酸含量顯著升高(P<0.05),丙酸含量呈上升趨勢。

表2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對42日齡羔羊瘤胃發(fā)酵指標的影響Table 2 Effects of adding tributyrin on rumen fermentation indexes of 42 d lambs during perinatal period

2.2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對瘤胃微生物α多樣性的影響

如圖1所示:本次測序共獲得OTU 927條,其中,L-TB組與L-NEB組菌種差異較大,L-TB組有641條OTU,L-NEB組有745條OTU,L-TB組與L-NEB組共享的OTU共有459條,L-TB組特有182條,L-NEB組特有286條。L-TB組與L-NEB組OTU條數(shù)差異明顯,說明圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對羔羊瘤胃菌群有影響。微生物α多樣性分析顯示各組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均逐漸趨于平緩,說明樣品的測序深度已滿足試驗要求。通過計算Shannon、CHAO、Simpson和ACE指數(shù),發(fā)現(xiàn)L-NEB組的Shannon指數(shù)顯著高于L-TB組(P<0.05),表明L-TB組羔羊的瘤胃微生物物種多樣性顯著低于L-NEB組。

圖1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對羔羊瘤胃微生物菌群多樣性指數(shù)的影響Fig.1 Effects of tributyrin supplementation on microbial diversity index in rumen of lambs during perinatal period

2.3 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對瘤胃微生物β多樣性的影響

與L-NEB組相比,L-TB組羔羊瘤胃的微生物群落構(gòu)成存在一定差異卻不顯著(圖2-A)?；赪eighted UnFrac距離的UPGMA聚類樹(圖2-B)顯示,樣品菌群結(jié)構(gòu)基于母代是否飼喂三丁酸甘油酯大致聚集成2類,說明添加三丁酸甘油酯對羔羊的瘤胃菌群產(chǎn)生一定影響。通過PCoA分析(圖2-C)可知,L-TB組和L-NEB組在瘤胃微生物群落組成上存在一定差異,且解釋度好(橫縱坐標軸標題括號里的百分比表示的是橫縱坐標軸對菌群結(jié)構(gòu)總體差異的解釋度,一般認為PCoA1和PCoA2兩者之和在50%以上為好)。

2.4 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后羔羊瘤胃微生物物種注釋及差異分析

如表3所示:在門水平上,瘤胃微生物中主要菌群構(gòu)成為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)。L-TB組羔羊瘤胃中厚壁菌門的豐度相較L-NEB組顯著上升(P<0.05),而藍藻菌門豐度相較L-NEB組顯著下降(P<0.05)。在屬水平上,L-TB組羔羊瘤胃中厚壁菌門的Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014豐度相較L-NEB組均顯著上升(P<0.05)。

3 討論

3.1 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對羔羊瘤胃發(fā)酵指標的影響

瘤胃作為反芻動物的第一胃,對反芻動物的健康和正常生長影響深遠[16-17]。瘤胃pH值受唾液、食糜等多方面因素的影響,能夠在一定程度上反映反芻動物的健康狀況,通常認為羊瘤胃的正常pH值為5.0～7.5[18-19],L-TB與L-NEB的pH值均處于正常水平。有研究報道稱,在瘤胃發(fā)酵中,丙酸含量的提高與羔羊的高生長性能有關(guān)[20]。從能量轉(zhuǎn)化效率角度來看,瘤胃VFA中丙酸的能量轉(zhuǎn)化效率最佳,丁酸次之,乙酸最差[21]。結(jié)合本試驗測得VFA數(shù)據(jù)來看,圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯后,L-TB組乙酸含量顯著升高,意味著有更多的脂質(zhì)被合成,丙酸含量呈上升趨勢,可以產(chǎn)生較多的葡萄糖用以供能。這說明在母羊圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯可在一定程度上改善羔羊?qū)I養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用率。

3.2 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對瘤胃微生物α多樣性和β多樣性的影響

本試驗結(jié)果顯示,在OTU水平上,L-NEB組特有OTU數(shù)較L-TB組多104條,而L-NEB組的Shannon指數(shù)又顯著高于L-TB組,表明L-TB組羔羊的瘤胃微生物物種多樣性顯著低于L-NEB組,提示添加三丁酸甘油酯顯著降低了微生物多樣性。有研究表明,三丁酸甘油酯可能通過抑制有害菌的生長,極顯著降低了犢牛空腸以及結(jié)腸的微生物多樣性[22],本試驗結(jié)果與其一致。基于UPGMA聚類樹和PCoA結(jié)果可以看出,L-NEB組和L-TB組羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異卻不顯著,提示添加三丁酸甘油酯對羔羊的瘤胃菌群產(chǎn)生一定影響。

3.3 圍產(chǎn)期添加三丁酸甘油酯對瘤胃微生物物種注釋及差異的影響

門水平上的分析表明,相比L-NEB組,L-TB組羔羊瘤胃微生物中厚壁菌門的豐度顯著提高,藍藻菌門豐度顯著下降。厚壁菌門中存在如乳酸菌、瘤胃球菌等多種有益菌[22],而藍藻菌門中某些屬的菌種易產(chǎn)各種各樣的生物毒素,例如神經(jīng)毒素、肝毒素、細胞毒素及內(nèi)毒素等,對動物的健康構(gòu)成嚴重危害[23]。Cox等[24]的研究結(jié)果表明,嬰兒期的微生物群相互作用可能是長期宿主代謝效應(yīng)的關(guān)鍵決定因素,厚壁菌門豐度的提升將可能長期有利于L-TB組羔羊瘤胃有益菌的定殖,為其營造健康瘤胃環(huán)境,而L-NEB組藍藻菌門的豐度顯著提升對該組的負面影響可能將長期存在。本試驗中,門水平上豐度最高的微生物分別是厚壁菌門和擬桿菌門,這與反芻動物瘤胃微生物的其他研究結(jié)果相一致[25]。屬水平上的分析表明,相比L-NEB組,L-TB組羔羊瘤胃微生物中Succiniclasticum和RuminococcaceaeUCG014豐度顯著提高,而這兩者又屬于厚壁菌門,進一步印證添加三丁酸甘油酯有利于提升羔羊瘤胃厚壁菌門豐度,對有益菌的定殖提供有利條件。反芻動物圍產(chǎn)期母體的營養(yǎng)環(huán)境對初乳的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26],而初乳又影響著羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu),這可能與本試驗所產(chǎn)生的影響相關(guān)。