銅離子脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚急性毒性、抗氧化及免疫相關(guān)酶活性的影響

呂國(guó)華,鄭冰清,馬學(xué)艷,金武,李紅霞,宋長(zhǎng)友,徐跑,顧若波,聞海波*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院,江蘇 無錫 214128;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214081)

淡水石首魚(Aplodinotusgrunniens)屬鱸形目、石首魚科,俗稱淡水大黃魚、淡水黃花魚,其適應(yīng)性廣,是北美洲分布最廣泛的淡水魚類[1]。淡水石首魚因肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富且無肌間刺而受到人們喜愛,并具有巨大的經(jīng)濟(jì)前景[2]。目前國(guó)外對(duì)淡水石首魚研究較多,主要有生長(zhǎng)與繁殖特性[3-6]、捕撈特征[7]、食性差異[8]以及出血病抗體檢測(cè)[9]等方面,而國(guó)內(nèi)對(duì)淡水石首魚研究較少,僅見營(yíng)養(yǎng)成分分析[10]、人工催產(chǎn)與胚胎發(fā)育研究[11]、幼魚外部形態(tài)與內(nèi)部解剖學(xué)特征研究[2]、線粒體基因組特征研究[12]以及饑餓脅迫對(duì)形體指標(biāo)、肌肉脂肪酸和肝臟代謝基因表達(dá)的影響[13]等方面。中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心于2016年從美國(guó)引進(jìn)一批淡水石首魚并開展人工馴養(yǎng)和繁育試驗(yàn),取得了顯著成效,為我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)提供了新的養(yǎng)殖品種。

銅是廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中殺藻劑和殺菌劑中的有效成分,水體中Cu2+超標(biāo)會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水體產(chǎn)生嚴(yán)重的污染,并通過生物富集作用對(duì)魚類產(chǎn)生較強(qiáng)的毒害作用[14],引起魚類行為異常、生理功能紊亂以及細(xì)胞組織病變甚至死亡等[15]。銅也是生物體內(nèi)最基本的微量重金屬元素之一,作為氧化還原劑或氧載體存在于30多種酶中,參與脊椎動(dòng)物體內(nèi)黑色素的合成和造血等過程,是魚體內(nèi)不可或缺的微量元素[15]。

有關(guān)重金屬污染對(duì)魚類毒性效應(yīng)的研究已有不少報(bào)道[15-17],但Cu2+對(duì)淡水石首魚抗氧化以及免疫系統(tǒng)的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)主要研究了水體中不同濃度Cu2+脅迫對(duì)石首魚幼魚死亡率的影響以及對(duì)石首魚幼魚肝臟組織中的過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST),鰓Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase),腸道中α-淀粉酶(α-amylase,α-AMS)、脂肪酶(lipase,LP)和胃蛋白酶(pepsin,PP)活性以及皮質(zhì)醇(cortisol,COR)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響,以闡明重金屬Cu2+對(duì)石首魚幼魚的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的毒性作用,為水體Cu2+對(duì)魚類的毒性作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2016年美國(guó)引進(jìn)的淡水石首魚F2代幼魚為試驗(yàn)對(duì)象,質(zhì)量為(47.2±8.7)g,全長(zhǎng)(17.8±1.0)cm。試驗(yàn)前30 d選取活力良好的幼魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng),試驗(yàn)用水為曝氣自來水,溫度(17±1)℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Cu2+急性毒性試驗(yàn)在0.1～1.5 mg·L-1Cu2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)根據(jù)等間距法選取5個(gè)不同質(zhì)量濃度組:0.100、0.197、0.387、0.762、1.500 mg·L-1,以及1個(gè)不含Cu2+的對(duì)照組,每組15尾魚。試驗(yàn)過程中不投喂、不換水,水溫(17±1)℃,每8 h觀察1次,記錄死亡數(shù)量并將死魚撈出。試驗(yàn)進(jìn)行96 h。根據(jù)死亡數(shù)據(jù)采用直線內(nèi)插法計(jì)算24和96 h的毒性試驗(yàn)回歸方程、半致死濃度和安全濃度。

1.2.2 Cu2+脅迫對(duì)肝臟、鰓和腸道酶活性影響試驗(yàn)根據(jù)急性脅迫試驗(yàn),選定0.197 mg·L-1Cu2+作為酶活性試驗(yàn)濃度,同時(shí)設(shè)定銅離子濃度為0 mg·L-1的空白對(duì)照組,每組3個(gè)平行,每個(gè)平行放20尾。分別在0、4、12、24、48 和96 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,每個(gè)平行組取3條,用魚安定(MS-222)將石首魚幼魚麻醉,測(cè)量體重、體長(zhǎng)等數(shù)據(jù),分別取肝臟、鰓和前腸暫存液氮罐中,置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法

準(zhǔn)確稱取待測(cè)的鰓、肝臟、前腸等組織,加入一定體積的PBS(pH7.4),用組織勻漿儀充分勻漿,2 500 r·min-1離心20 min,取上清液分裝冷凍后分別進(jìn)行過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(GPx)、谷胱甘肽(GSH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)、α-淀粉酶(α-AMS)、脂肪酶(LP)和胃蛋白酶(PP)酶活性以及皮質(zhì)醇(Cortisol)、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)。試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對(duì)淡水石首魚幼魚的急性毒性

從表1可以看出:Cu2+質(zhì)量濃度范圍在0.100～0.197 mg·L-1時(shí)淡水石首魚幼魚死亡率較低,且48、72 和96 h沒有累加死亡;Cu2+濃度高于0.387 mg·L-1時(shí)死亡率較高,96 h的死亡率可達(dá)93.33%;而24 h時(shí)0.762、1.500 mg·L-1Cu2+處理組死亡率已達(dá)100%。根據(jù)死亡率計(jì)算Cu2+脅迫淡水石首魚幼魚24 h回歸方程,Y=1.405 4X+0.024 6,R2=0.888 7,半數(shù)致死濃度為0.313 mg·L-1;96 h回歸方程,Y=1.435 5X+0.038 2,R2=0.827 3,半數(shù)致死濃度為0.291 mg·L-1,安全濃度為0.029 mg·L-1。

表1 不同Cu2+質(zhì)量濃度處理淡水石首魚的死亡率Table 1 Mortality of juvenile Aplodinotus grunniens exposed to different Cu2+ concentrations %

2.2 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟CAT活性的影響如圖1-A所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟CAT活性無顯著差異(P>0.05),而試驗(yàn)組CAT活性呈先上升后下降趨勢(shì),48 h 時(shí)達(dá)到最高(127.23±4.77)ng·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

圖1 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化性酶活性的影響Fig.1 Effects of Cu2+ stress on the activity of antioxidant enzymes in the liver of juvenile A. grunniensA. CAT:Catalase;B. SOD:Superoxide dismutase;C. T-AOC:Total antioxidant capacity;D. GPx:Glutathione peroxidase不同字母表示試驗(yàn)組不同時(shí)間存在顯著差異,*表示試驗(yàn)組與對(duì)照組存在差異。下同。Different letters indicate that there are significant differences in experimental group at different times,*indicates that there is a difference between the experimental group and the control group. The same below.

2.2.2 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟SOD活性的影響如圖1-B所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟SOD活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組SOD活性呈先升高后下降的趨勢(shì),在4 h達(dá)到最大值(146.19±8.36)ng·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),24 h開始均顯著低于對(duì)照組,96 h達(dá)到最低值(88.36±10.60)ng·g-1。4 h 時(shí)SOD活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),96 h時(shí) SOD活性與24 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.3 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟T-AOC的影響如圖1-C所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟T-AOC無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組T-AOC隨脅迫時(shí)間增加先上升又下降然后又上升,在4 h達(dá)到最大值(154.94±21.65)U·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),48 h時(shí)達(dá)到最小值(95.69±25.76)U·g-1并顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其他時(shí)間與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。4 h時(shí) T-AOC 與 12 h 差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h時(shí)T-AOC顯著低于4 h和12 h(P<0.05),而與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.4 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟GPx活性的影響如圖1-D所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟GPx活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組GPx活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降再上升趨勢(shì),在4 h時(shí)達(dá)最高(702.21±76.05)ng·g-1且顯著高于對(duì)照組(P<0.05),48 h達(dá)最低(525.90±68.62)ng·g-1并顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其他時(shí)間與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)GPx活性與0 h差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.5 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟GSH活性的影響如圖2-A所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟GSH活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組GSH活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢(shì),在4 h時(shí)達(dá)最高(2 983.13±362.47)μg·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),96 h時(shí)最低為(1 890.14±122.58)μg·g-1并顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其他時(shí)間與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)GSH活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48和96 h GSH活性與24 h差異不顯著(P>0.05),顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

圖2 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化酶活性(A—C)和皮質(zhì)醇(D)、丙二醛(E)含量的影響Fig.2 Effects of Cu2+ stress on the activity of antioxidant enzymes(A-C)and cortisol(COR,D),malondialdehyde(MDA,E)content in the liver of juvenile A. grunniensGSH:Glutathione;ALT:Alamine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase.

2.2.6 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟ALT活性的影響如圖2-B所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟ALT活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組ALT活性隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),12 h開始顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(197.17±40.39)ng·g-1。96 h ALT活性顯著高于0和4 h(P<0.05),與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.7 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟AST活性的影響如圖2-C所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟AST活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組AST活性隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),12 h開始顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(43 848.48±3 665.62)pg·g-1。48和96 h AST活性顯著高于0 h,但與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.8 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟皮質(zhì)醇含量的影響如圖2-D所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟皮質(zhì)醇含量無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組皮質(zhì)醇含量隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢(shì),4 h時(shí)達(dá)最高(1 378.14±72.68)ng·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),48 h皮質(zhì)醇含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),96 h 最低為(962.85±104.93)ng·g-1,但與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)皮質(zhì)醇含量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),24、48 和96 h皮質(zhì)醇含量無顯著性差異(P<0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.9 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟MDA含量的影響如圖2-E所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚肝臟MDA含量無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組MDA含量隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),4 h開始顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(150.10±21.44)nmol·g-1。24和96 h MDA含量顯著高于0 h(P<0.05),但與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性的影響

如圖3-A所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組Na+-K+-ATP活性隨脅迫時(shí)間增加先上升后下降并保持穩(wěn)定,在4 h時(shí)達(dá)最高(135.65±9.40)μmol·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在48 h時(shí)最低為(95.83±13.22)μmol·g-1并顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4 h時(shí)Na+-K+-ATP活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h Na+-K+-ATP活性顯著低于4和12 h,與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚鰓和腸道酶活性的影響Fig.3 Effects of Cu2+ stress on gill and intestinal enzyme activity of juvenile A. grunniens

2.4 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚腸道酶活性的影響

2.4.1 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚腸道α-淀粉酶活性的影響如圖3-B所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚腸道α-淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組α-淀粉酶活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降再上升趨勢(shì),在4 h時(shí)最高為(2 097.98±93.66)pg·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),48 h時(shí)最低為(1 142.41±399.89)pg·g-1并顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4 h時(shí)α-淀粉酶活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h時(shí)與0和96 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.4.2 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚腸道脂肪酶活性的影響如圖3-C所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚腸道脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組脂肪酶活性隨脅迫時(shí)間增加先上升后下降并保持穩(wěn)定,在4 h時(shí)最高為(1 057.34±138.01)ng·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在96 h時(shí)最低為(481.60±138.43)ng·g-1,與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)腸道脂肪酶活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.4.3 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚腸道胃蛋白酶活性的影響如圖3-D所示:不同處理時(shí)間對(duì)照組淡水石首魚幼魚胃蛋白酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組胃蛋白酶活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢(shì),在4 h時(shí)最高為(336.57±15.96)ng·g-1并顯著高于對(duì)照組(P<0.05),在96 h時(shí)最低為(228.84±8.99)ng·g-1且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。4 h時(shí)胃蛋白酶活性與12 h差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),24和 96 h 胃蛋白酶活性與48 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

3 討論

3.1 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚存活的影響

工業(yè)廢水的不合理排放以及農(nóng)業(yè)殺蟲劑的濫用會(huì)對(duì)水體生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響,威脅魚類生存。銅作為魚類不可或缺的微量元素,在水體中的濃度影響石首魚的健康養(yǎng)殖。研究表明:不同物種對(duì)Cu2+的耐受性和敏感程度存在較大差異,日本黃姑幼魚(Nibeajaponica)的Cu2+安全濃度為0.263 mg·L-1[17],中國(guó)花鱸幼魚(Lateolabraxmaculatus)的Cu2+安全濃度為0.086 mg·L-1[18],草魚幼魚(Ctenopharyngodonidella)的Cu2+安全濃度為0.008 mg·L-1[14],廣東魴幼魚(Megalobramaterminalis)的Cu2+安全濃度為0.01 mg·L-1[19]。本研究發(fā)現(xiàn)淡水石首魚幼魚對(duì)Cu2+的耐受性較差,Cu2+的安全濃度為0.029 mg·L-1。根據(jù)《危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級(jí)試驗(yàn)方法:GB/T 21281—2007》可判斷Cu2+對(duì)淡水石首魚幼魚的危害等級(jí)為劇毒?！段鬯C合排放標(biāo)準(zhǔn):GB 8978—1996》中銅排放一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為0.5 mg·L-1,遠(yuǎn)高于淡水石首魚幼魚的安全濃度,含銅廢水的排放將給魚類和其他水生生物帶來較大的危害,因此在養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意水環(huán)境管理和含銅水產(chǎn)藥物的安全使用。但本試驗(yàn)得到的淡水石首魚幼魚Cu2+安全濃度是在Cu2+單獨(dú)作用下的試驗(yàn)結(jié)果,在實(shí)際生產(chǎn)中水中的懸浮物、有機(jī)質(zhì)、鈣鎂離子等都能降低硫酸銅的毒性[17],因此需要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行具體分析和處理。

3.2 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

受到重金屬脅迫,魚體會(huì)產(chǎn)生不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增多,當(dāng)超出魚體耐受范圍時(shí),會(huì)造成魚體脂質(zhì)過氧化損傷。研究表明,魚體清除ROS存在一定規(guī)律,首先會(huì)利用一些小分子非酶抗氧化產(chǎn)物(例如GSH、維生素C、維生素E等)清除過多ROS,當(dāng)非酶抗氧化產(chǎn)物無法清除過多ROS時(shí),魚體則開始合成抗氧化酶來緩減氧化壓力[19]。SOD是一種金屬酶,負(fù)責(zé)清除超氧陰離子,形成過氧化氫,而CAT則負(fù)責(zé)將過氧化氫分解為水和分子氧[20]。GPx能以GSH為特異性底物,降解有機(jī)過氧化物和過氧化氫,維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整[21]。高春生等[22]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度較低時(shí)黃河鯉(Cyprinuscarpio)肝臟SOD、GPx活性和T-AOC隨脅迫時(shí)間增加酶活性先上升后下降,Cu2+濃度較高時(shí)則表現(xiàn)明顯的抑制作用。潘魯青等[23]研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的金屬離子刺激可使中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)肝胰臟SOD和CAT活性升高,而較長(zhǎng)時(shí)間的刺激則會(huì)導(dǎo)致酶活性受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:在受到Cu2+脅迫后淡水石首魚幼魚SOD、GSH、GPx活性和T-AOC均顯著上升,在4 h時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)闄C(jī)體在受到Cu2+脅迫后分泌大量抗氧化酶來清除過多的ROS。96 h時(shí)SOD和GSH活性表現(xiàn)為顯著的抑制作用,這是因?yàn)殡S脅迫時(shí)間延長(zhǎng),ROS不斷消耗產(chǎn)生的抗氧化酶,且ROS產(chǎn)生速度非?？?未及時(shí)清除的自由基會(huì)對(duì)肝臟細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的傷害,導(dǎo)致酶活性下降[24]。CAT活性顯著升高后恢復(fù),且應(yīng)激響應(yīng)速度較其他抗氧化酶滯后,可能與不同酶在應(yīng)急防御體系中承擔(dān)的功能不同有關(guān)[25]。研究表明SOD是機(jī)體防御自由基侵害的第一道防線[26],也是受到Cu2+脅迫最敏感的抗氧化酶[27]。本研究結(jié)果顯示SOD活性相較于其他抗氧化酶受Cu2+抑制最嚴(yán)重,因此可作為早期Cu2+污染的首選指示目標(biāo)。

魚類在受到刺激后,頭腎細(xì)胞會(huì)在下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPI)分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素作用下分泌產(chǎn)生皮質(zhì)醇激素,皮質(zhì)醇常被作為衡量魚類應(yīng)激程度的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致翹嘴鲌(Culteralburnus)[28]和斑點(diǎn)叉尾洄(Ictaluruspunctatus)[29]體內(nèi)皮質(zhì)醇含量快速增加,且受到的刺激越大皮質(zhì)醇含量越高[30]。本試驗(yàn)中,Cu2+脅迫4 h 皮質(zhì)醇含量會(huì)顯著升高,然后慢慢下降,說明魚體剛接觸Cu2+環(huán)境時(shí)受到刺激較大,分泌大量皮質(zhì)醇。但隨時(shí)間延長(zhǎng)皮質(zhì)醇含量下降,推測(cè)可能是魚體內(nèi)銅耐受策略起作用,促進(jìn)了體內(nèi)皮質(zhì)醇的清除[31-32]。

MDA是機(jī)體細(xì)胞受到攻擊時(shí),由生物大分子和膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生,MDA含量高低可以反映細(xì)胞受損傷程度[33-34]。Cd暴露會(huì)對(duì)草魚(Ctenopharyngodonidellus)肝臟產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用,導(dǎo)致MDA含量上升[35]。ALT和AST是廣泛存在于肝組織細(xì)胞內(nèi)的氨基轉(zhuǎn)移酶,在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用,當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí),會(huì)導(dǎo)致ALT和AST活性升高,ALT和AST也被認(rèn)為是肝功能受損的檢測(cè)指標(biāo)[36]。üner等[37]研究發(fā)現(xiàn)有毒物質(zhì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損傷時(shí),會(huì)導(dǎo)致ALT活性突然持續(xù)性增強(qiáng)。王少博等[16]研究發(fā)現(xiàn)鎘中毒早期草魚肝臟ALT活性顯著上升。王丙蓮等[38]研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cd2+會(huì)引起泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)肝胰臟ALT和AST活性升高。本試驗(yàn)中,MDA含量和ALT、AST活性隨脅迫時(shí)間增加顯著升高,MDA含量從脅迫4 h開始顯著高于對(duì)照組,ALT和AST活性從12 h開始顯著高于對(duì)照組。這說明Cu2+脅迫初期,即對(duì)淡水石首魚幼魚肝臟造成損傷,且隨脅迫時(shí)間增加損傷不斷加重,最終可能造成肝功能損傷。

3.3 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性的影響

Na+-K+-ATP在生物體能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞方面具有重要作用。研究表明水體中的銅短時(shí)間內(nèi)(7 d)在魚鰓中的累積量大于肝臟和腎臟,鰓組織也最先受到Cu2+的毒性作用[39]。高春生等[39]研究發(fā)現(xiàn),Cu2+濃度較低時(shí)(0.01～0.05 mg·L-1)對(duì)黃河鯉鰓Na+-K+-ATP活性具有促進(jìn)作用,Cu2+濃度較高時(shí)(>0.1 mg·L-1)表現(xiàn)為抑制作用,且隨處理時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用增強(qiáng)。苗晶晶等[40]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+脅迫對(duì)褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)鰓絲Na+-K+-ATP酶有顯著的劑量和時(shí)間效應(yīng),Na+-K+-ATP酶活性隨脅迫時(shí)間增加顯著上升后又逐漸趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:在0.197 mg·L-1Cu2+脅迫下,淡水石首魚幼魚鰓組織中Na+-K+-ATP活性在4 h顯著上升,然后顯著下降并逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)轸~體暴露在Cu2+水體中,會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)Na+和Ca2+短暫流失,魚體立即開啟應(yīng)激響應(yīng)即增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活性來維持體內(nèi)離子平衡,隨著進(jìn)入體內(nèi)的重金屬增多,金屬離子與膜上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致酶活性顯著下降。魚類去毒生理反應(yīng)即魚鰓黏液分泌量增加,改變魚鰓微環(huán)境中金屬離子的分布或提高能絡(luò)合金屬離子的金屬硫蛋白濃度等方法使Na+-K+-ATP酶活性逐漸趨于穩(wěn)定[40]。本試驗(yàn)結(jié)果與高春生等[39]研究結(jié)果不同,可能與魚種類和Cu2+濃度及脅迫時(shí)間有關(guān)。

3.4 Cu2+脅迫對(duì)淡水石首魚幼魚腸道酶活性的影響

消化酶活性是判斷魚類消化生理的主要指標(biāo),α-淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶分別負(fù)責(zé)消化道中淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的消化與代謝。研究發(fā)現(xiàn)金屬離子可以與底物和酶產(chǎn)生極強(qiáng)的親和力,從而改變酶活性[41]。重金屬Cu2+誘導(dǎo)酶活性增加可能是因?yàn)镃u2+與調(diào)節(jié)操控基因的阻遏蛋白形成復(fù)合物導(dǎo)致阻遏作用失效,酶合成增加;而Cu2+對(duì)酶活性的抑制作用可能是因?yàn)镃u2+與機(jī)體產(chǎn)生的金屬硫蛋白結(jié)合而解毒,金屬硫蛋白飽和后多余的Cu2+與消化酶活性中心的半胱氨酸殘基的巰基結(jié)合或者與酶的非活性中心部分結(jié)合,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活抑制了酶活性[42]。陳肖肖等[43]研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cu2+對(duì)泥蚶(Tegillarcagranosa)淀粉酶活性起到先激活后抑制作用;高濃度Cu2+對(duì)脂肪酶活性起到先激活后抑制作用;Cu2+對(duì)胃蛋白酶起到先激活后抑制作用。王海英等[44]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道蛋白酶有抑制作用。章龍珍等[42]對(duì)中華鱘(Acipensersinensis)幼魚研究發(fā)現(xiàn),Cu2+對(duì)消化道中的淀粉酶和蛋白酶有抑制作用,而對(duì)脂肪酶具有激活作用。Jiang等[45]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)鯽魚(Carassiuscarassius)腸道中蛋白酶和淀粉酶均有抑制作用。綜上研究表明:當(dāng)水體Cu2+達(dá)到一定濃度時(shí),對(duì)水生動(dòng)物消化酶存在一定的激活或抑制作用,不同種類消化酶的作用效果并不完全一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,淡水石首魚幼魚在受到0.197 mg·L-1Cu2+脅迫時(shí),α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶均顯著上升后又顯著下降。這說明短時(shí)間(<4 h)的Cu2+脅迫對(duì)α-淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶活性均起到激活作用,加快淡水石首魚幼魚對(duì)淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的消化,而長(zhǎng)時(shí)間(≥24 h)脅迫則會(huì)抑制α-淀粉酶和胃蛋白酶活性,影響淀粉和蛋白質(zhì)的消化,但不會(huì)抑制脂肪酶活性。