不結球白菜BcGR2.1基因的功能驗證及響應光氧化脅迫研究

陶瑜,李燕,柏艾梅,虞章紅,侯喜林,李英

(南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新利用全國重點實驗室/農業(yè)農村部華東地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室/園藝作物種質創(chuàng)新與利用教育部工程研究中心/園藝學院,江蘇 南京 210095)

不結球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)起源于中國,栽培歷史悠久,性喜冷涼,是中國南方最重要的葉用蔬菜之一[1]。夏季的高溫和強光照條件會引發(fā)光氧化脅迫,誘導光合電子傳遞鏈過度還原,造成葉綠體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)爆發(fā)性累積,在很大程度上影響了不結球白菜的正常生長發(fā)育而降低不結球白菜的產量和品質[2]。因此,光氧化脅迫下及時有效地清除葉綠體中產生的ROS對增強植物抗高溫、強光能力具有明顯的作用效果[3]。為進一步滿足消費者的市場需求,實現全年供應生產,關于不結球白菜在耐熱、耐強光等利于夏季反季節(jié)栽培的相關研究尤為重要。

還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是含有巰基的抗氧化物質,能夠儲存和轉運還原態(tài)硫、調節(jié)酶活性和參與氧化還原反應控制氧化還原狀態(tài)[4-5]。GSH能夠直接有效地清除植物中ROS,防止其積累[6]。在清除ROS的酶促反應中,GSH作為還原劑參與抗壞血酸(AsA)的再生,自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG),而GSSG在谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)的作用下能夠及時有效地被還原成GSH[7]。因此,GR對于維持植物體內GSH含量、保持細胞谷胱甘肽庫的氧化還原狀態(tài)(GSH/GSSG),以及提高植物對非生物脅迫的耐受性具有重要影響。

GR是一種黃素蛋白氧化還原酶,其依靠煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(NADPH)提供電子實現GSSG向GSH的轉變[8]。GR蛋白分布在不同的細胞器中,在植物的細胞質、線粒體、葉綠體以及過氧化物酶體中均檢測到了GR活性[9]。許多高等植物中只能分離鑒定出2種不同類型的GR,根據亞細胞定位可分為胞質GR和雙向定位于葉綠體和線粒體上的葉綠體GR[10]。在不結球白菜中,GR也有2種亞細胞定位類型:BcGR1定位于細胞質,BcGR2定位于葉綠體[11]。在高等植物中葉綠體GR活性占細胞中GR總酶活性的一半以上,參與植物體內不同信號途徑,調控植物的抗逆性或影響植物的生長發(fā)育[3,12]。

GR作為抗氧化物酶參與植物的生長調控,目前對于該酶的研究大多集中在其對脅迫處理的響應上。例如:在干旱脅迫下,水稻、玉米、小麥等物種的GR活性會提高[13];在鹽脅迫下,番茄、大豆、棉花和柑橘等物種的GR活性也會提高,抗氧化能力增強,而敲除水稻GR3基因會導致其對鹽脅迫的敏感性提高[14];在臭氧和百草枯導致的氧化脅迫下,過表達GR基因能夠提高煙草光合作用[15-16];在低溫脅迫下,GR基因表達被抑制的番茄體內H2O2含量上升,更易對冷害脅迫敏感[17]。在不結球白菜中,BcGR1.1則可以通過提高GR、抗氧化酶的活性和對AsA的利用,來提高植物對ROS的清除能力,從而增強植物對銅脅迫的耐受性[11]。但BcGR2在不結球白菜中的基因功能及其響應光氧化脅迫的機制尚不清楚。

本研究以不結球白菜‘蘇州青’為材料,對BcGR2.1進行功能驗證。利用農桿菌介導的蘸花法和病毒誘導的基因沉默(VIGS)技術[18]分別獲得了過表達轉基因擬南芥和BcGR2.1沉默‘蘇州青’,并對過表達BcGR2.1擬南芥和BcGR2.1沉默‘蘇州青’采用光下甲基紫精(MV)處理誘導其產生光氧化脅迫[19],以進一步研究BcGR2.1的基因功能和其在響應光氧化脅迫中的作用,為今后更深入研究植物GR的功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為不結球白菜品種‘蘇州青’,由南京農業(yè)大學園藝學院白菜系統生物學實驗室提供。將其種子催芽2～3 d后移栽至滅菌基質中,置于人工氣候室培養(yǎng),光照/黑暗時間為16 h/8 h,晝/夜溫度為24 ℃/18 ℃,相對濕度(80±5)%。

哥倫比亞野生型擬南芥種子在消毒后均勻平鋪在1/2 MS上培養(yǎng)。種子消毒過程:75%(體積分數)的乙醇清洗1 min,無菌水清洗3～5次,每次5 min;用10%(體積分數)次氯酸鈉洗滌種子10 min,無菌水洗滌3～5次,每次5 min。整個過程都是在超凈工作臺中完成。對于萌發(fā)15 d的擬南芥幼苗,選擇生長狀態(tài)整齊一致的移栽到含有滅菌基質的穴盤中,培養(yǎng)條件與‘蘇州青’一致,并在開花期進行農桿菌侵染。

1.2 不結球白菜BcGR2.1基因克隆

取不結球白菜‘蘇州青’4葉1心時期的葉片0.1 g,用RNA Simple Total RNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]進行葉片總RNA的提取,使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)反轉錄成cDNA。參考擬南芥數據庫中AtGR2(AT3G54660)和大白菜數據庫中BraGR2(Bra007087)序列,在不結球白菜數據庫(http://tbir.njaμ.edu.cn/NhCCDbHubs/index.jsp)中進行BLAST序列比對,查找同源基因,根據同源基因序列設計特異性引物BcGR2.1-F/R(表1)。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences in this study

以不結球白菜‘蘇州青’的cDNA為模板,利用BcGR2.1-F/R進行PCR擴增反應。PCR反應體系(20 μL):模板1 μL,Prime STAR Max Premix(2×)(TaKaRa)10 μL,正、反引物各1 μL,ddH2O 7 μL。反應程序:94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR產物在12 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳20 min,確定片段的長度和單一性。目的片段用凝膠回收試劑盒(AG)回收,連接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金生物技術有限公司)載體。連接體系(5 μL):pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 1 μL,膠回收產物 4 μL。反應程序:37 ℃ 30 min,4 ℃保存。轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α后涂布于含50 mg·L-1卡那霉素(Kanamycin)的LB培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后挑取單克隆菌落進行PCR驗證,將陽性單克隆的菌液送至南京擎科生物科技有限公司測序,獲得目的基因。

1.3 BcGR2.1生物信息學分析

利用Bioxm2.7軟件比對測序得到的核酸序列和翻譯不結球白菜BcGR2.1基因編碼的氨基酸序列,并計算蛋白質相對分子質量和等電點。在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中對BcGR2.1氨基酸序列進行BLAST比對,下載比對結果中不同物種的GR2氨基酸序列。采用MEGA 7軟件構建系統發(fā)育樹,蛋白序列保守結構域分析用GeneDoc 2.7.0.0完成。

1.4 光氧化脅迫處理

待不結球白菜‘蘇州青’生長至4葉1心時期,選擇長勢整齊一致的植株,采用光下MV處理誘導其產生光氧化脅迫。于光期開始時使用小噴壺將150 μmol·L-1MV(含0.01%吐溫-20)均勻噴灑在‘蘇州青’葉片上,對照組噴灑等量含0.01%吐溫-20的清水,培養(yǎng)溫度為22 ℃,光照周期為16 h光照、8 h黑暗。分別在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h時取樣,取0.1 g葉片提取RNA。同樣用150 μmol·L-1MV均勻噴灑在BcGR2.1沉默‘蘇州青’和PTY空載葉片上,待出現植株葉片開始變白和萎蔫時統一取樣。每個樣品進行3次獨立生物學重復。

將野生型(WT)和T3代過表達轉基因擬南芥(35S∷BcGR2.1)移栽至滅菌基質中生長21 d左右,用40 μmol·L-1MV噴施處理轉基因擬南芥(35S∷BcGR2.1)和WT植株葉片。觀察植株生長狀況及葉片形態(tài),在處理后12 h取樣。

1.5 實時熒光定量PCR分析

用RNA Simple Total RNA Kit(TianGen)提取總RNA,使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR(AG)將RNA反轉錄成cDNA。將cDNA模板稀釋5倍,RT-qPCR體系(20 μL):模板2 μL,HieffqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)10 μL,正、反引物各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應程序:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。用2-ΔΔCT方法[20]計算基因相對表達量,結果使用Prism 6以及Excel 2016軟件進行誤差分析和差異顯著性分析。

1.6 BcGR2.1過表達載體構建及過表達植株獲得

將BcGR2.1的CDS插入過表達載體 pTCK303,限制性內切酶為BamHⅠ和KpnⅠ。利用農桿菌凍融法將過表達載體pTCK303-BcGR2.1轉化農桿菌感受態(tài)GV3101(吐露港),再通過蘸花法轉入開花期的擬南芥中,待種子成熟后混合收種并記為T0代。將T0種子消毒后鋪在含有30 μg·L-1潮霉素和16 mg·L-1特美汀的1/2 MS平板上篩選,15 d后區(qū)分出陽性苗并移栽至滅菌基質中培養(yǎng)。通過PCR、RT-qPCR和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)化學染色檢驗出陽性植株,將T1代陽性苗單株收種后再次篩選得到T2及T3代。

1.7 病毒誘導基因沉默載體構建及植株接種

根據之前的報道[21],采用VIGS方法獲得了BcGR2.1沉默不結球白菜植株?；贐cGR2.1編碼序列選取40 bp(5′-TTGATCGAAGGCCGTGGAAAGGTTATAGACCCACACACTG-3′),另一條鏈反向互補,共80 bp,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。用金粉包裹50 μg的PTY和PTY-BcGR2.1質粒,基因槍轟擊生長2周的‘蘇州青’,使質粒轉入植物體內。將被基因槍轟擊的‘蘇州青’置于人工氣候室培養(yǎng),培養(yǎng)條件同1.1節(jié)。15 d后取發(fā)病植株葉片提取RNA,熒光定量PCR分析基因表達量,方法同1.5節(jié)。

1.8 AsA和T-AsA含量測定

采用Fontannaz等[22]的方法測定葉片中AsA含量。0.1 g葉片加入750 μL 0.1%草酸,振蕩混勻,4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min。22 μm濾膜(水系)過濾上清液后,用0.1%草酸稀釋2倍,使用超高效液相色譜儀(ultiMate 3000)測定AsA含量。AsA測定結束后加入二硫蘇糖醇(DTT)測定T-AsA含量。色譜條件:流動相0.1%乙酸,流速1 mL·min-1,進樣10 μL,柱溫30 ℃,檢測波長245 nm。

1.9 H2O2和葉綠素熒光參數測定

根據過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒(Solarbio)說明書測定光氧化脅迫條件下植物葉片中的H2O2含量。使用調制葉綠素熒光成像系統(Image-Pam)觀測光氧化脅迫下植物葉片中的葉綠素熒光參數變化。每個試驗均設3～4個生物學重復和3次技術重復,使用Prism 6軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜BcGR2.1基因克隆和系統進化分析

以不結球白菜‘蘇州青’葉片cDNA為模板,用特異性引物BcGR2.1-F/R進行PCR擴增,得到1 600 bp左右的目的片段(圖1)。測序結果分析表明:不結球白菜BcGR2.1基因含有1個1 626 bp的開放閱讀框(ORF),編碼541個氨基酸。

圖1 不結球白菜BcGR2.1基因PCR產物Fig.1 PCR product of the BcGR2.1 genein non-heading Chinese cabbageM:Marker 2000. The same below.

根據克隆所得的BcGR2.1基因編碼的氨基酸序列,在NCBI數據庫中通過BLASTp對BcGR2.1同源性進行檢索,共選擇11個物種的GR2蛋白。系統進化樹分析表明,BcGR2.1蛋白與蕪菁蛋白同源關系最近(圖2-a)。蛋白保守區(qū)域分析結果表明,BcGR2.1的保守區(qū)域和其他物種基本相同,僅蕪菁蛋白最前端比BcGR2.1蛋白多一個區(qū)域6(圖2-b)。

圖2 BcGR2.1與其他物種GR2蛋白的進化樹(a)和保守區(qū)域分析(b)Fig.2 Phylogenetic tree(a)and conserved domain analysis(b)of BcGR2.1in non-heading Chinese cabbage and other species

2.2 不結球白菜BcGR2基因對光氧化脅迫的響應

由圖3-a可見:MV處理12 h后,‘蘇州青’葉片出現白色塊狀斑駁,該現象隨著時間的延長而加劇;48 h時,葉片呈現大范圍失綠,且明顯萎蔫。RT-qPCR結果表明,不結球白菜‘蘇州青’中2個GR2同源基因的相對表達量在光氧化脅迫下有不同的變化。由圖3-b、c可見:BcGR2.1的基因表達量呈現先逐步上升后逐漸下降的趨勢,在8 h時表達量達到最大值,為對照的11倍。BcGR2.2的基因表達量在0～12 h 亦呈現先上升后下降趨勢,在4 h時達到最大值,為對照的2.5倍,12 h時表達量最低;12～48 h呈現先升后降的波動趨勢?？梢姽庋趸{迫處理能夠誘導不結球白菜BcGR2基因的表達,由于BcGR2.1較BcGR2.2對光氧化脅迫更為敏感,因此選擇BcGR2.1進行了后續(xù)的功能研究。

2.3 轉基因擬南芥植株的獲得與鑒定

為了進一步研究BcGR2.1的功能,通過構建BcGR2.1過表達載體(圖4-a),并使用蘸花法轉化擬南芥獲得了BcGR2.1過表達株系。對于每一代的轉基因擬南芥植株均進行了DNA水平檢測、GUS檢測、BcGR2.1基因表達量分析以及酶活測定。由圖4-b、c可見:陽性株系均能檢測出目的片段,而野生型未擴增出條帶,且陽性植株葉片經染色后呈藍色,而野生型無色。圖4-d、e結果顯示:陽性株系BcGR2.1基因的表達量顯著高于野生型植株,GR活性略高于野生型。

2.4 BcGR2.1過表達擬南芥在光氧化脅迫下的H2O2含量和葉綠素熒光參數

由圖5可見:在光氧化脅迫條件下,過表達BcGR2.1擬南芥葉片中PSⅡ最大光合量子產量Fv/Fm顯著高于野生型,為野生型的8倍。光氧化脅迫條件下,過表達BcGR2.1擬南芥和野生型葉片中PSⅡ實際光合量子產量Y(Ⅱ)、通過PSⅡ的電子傳遞速率ETR以及光化學淬滅系數qP均下降,但過表達植株仍顯著高于野生型。光氧化脅迫條件下過表達BcGR2.1擬南芥和野生型植株葉片中非光化學淬滅系數qN均上升,而野生型qN顯著高于過表達BcGR2.1擬南芥。葉綠素熒光參數測定結果表明,過表達BcGR2.1一定程度上維護了光氧化脅迫下植株的光合功能,增強了植株應對光氧化脅迫的耐受力。

圖5 光氧化脅迫下過表達BcGR2.1擬南芥H2O2含量和葉綠素熒光參數Fig.5 H2O2 content and chlorophyll fluorescence parameters in Arabidopsis with overexpression ofBcGR2.1 under photooxidative stressa. 光氧化脅迫下WT和過表達BcGR2.1擬南芥葉綠素熒光變化Changes in chlorophyll fluorescence of WT and BcGR2.1-overexpressed Arabidopsis under photooxidative stress;b. H2O2含量變化Changes in H2O2 content;c. Fv/Fm變化Changes in Fv/Fm;d—g. Y(Ⅱ)、ETR、qP及qN變化Changes in Y(Ⅱ),ETR,qP and qN.Fv/Fm:PS Ⅱ最大光合量子產量The maximal quantum yield of PS Ⅱ;Y(Ⅱ):PS Ⅱ實際光合量子產量Effective photochemical quantum yield of PS Ⅱ;ETR:通過PS Ⅱ的電子傳遞速率Electron transfer rate through PS Ⅱ;qP:光化學淬滅系數Coeffificient of photochemical fluorescence quenching;qN:非光化學淬滅系數Non-photochemical fluorescence quenching. MV-12 h:40 μmol·L-1 MV處理12 h 40 μmol·L-1 MV treatment for 12 h.

除此之外,過表達BcGR2.1擬南芥和野生型植株葉片H2O2含量測定結果表明:與對照相比,光氧化脅迫處理12 h后野生型擬南芥葉片中H2O2含量上升,而過表達BcGR2.1擬南芥植株葉片中的H2O2含量下降,且顯著低于野生型擬南芥。這表明在光氧化脅迫條件下,過表達BcGR2.1擬南芥具有比野生型更強的清除體內ROS能力。

2.5 過表達BcGR2.1擬南芥中AsA、T-AsA含量及AsA-GSH循環(huán)相關基因表達量

由圖6可見:BcGR2.1過表達擬南芥中AsA含量上升,為野生型擬南芥的2倍左右,T-AsA含量也顯著上升。這表明過表達BcGR2.1能夠有效提高植物中AsA含量。

圖6 過表達BcGR2.1擬南芥AsA和T-AsA含量測定Fig.6 Determination of AsA and T-AsA contents in Arabidopsis with overexpression of BcGR2.1

鑒于過表達BcGR2.1擬南芥中AsA和T-AsA含量的變化,進一步分析了光氧化脅迫條件下過表達BcGR2.1擬南芥中AsA-GSH循環(huán)相關基因的表達量。由圖7可見:光氧化脅迫條件下,BcGR2.1過表達株系中AtMDHAR1、AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2和AtGR1的表達量與未處理時相比均上調,其中AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2以及AtGR1的表達量顯著高于野生型。這說明過表達BcGR2.1基因的擬南芥通過改變AsA-GSH循環(huán)相關基因的表達,提高植物中AsA含量,增強其對光氧化脅迫的抗性。

圖7 光氧化脅迫下過表達BcGR2.1擬南芥AsA-GSH循環(huán)相關基因表達分析Fig.7 Expression analysis of AsA-GSH cycle related genes in Arabidopsis with overexpression ofBcGR2.1 under photooxidative stressAtMDHAR:擬南芥單脫氫抗壞血酸還原酶基因Monodehydroascorbate reductase genes of Arabidopsis;AtDHAR:擬南芥脫氫抗壞血酸還原酶基因Dehydroascorbate reductase genes of Arabidopsis;AtGPX:谷胱甘肽過氧化物酶基因Glutathione peroxidase genes of Arabidopsis;AtGR1:擬南芥谷胱甘肽還原酶基因1 Glutathione reductase gene 1 of Arabidopsis.

2.6 BcGR2.1基因沉默對不結球白菜AsA、T-AsA以及光氧化脅迫下H2O2含量的影響

由圖8-a可見:病毒接種2周后,PTY-BcGR2.1和PTY顯示花葉的表型。對可能喪失BcGR2.1功能的發(fā)病植株進行取樣,并使用RT-qPCR分析BcGR2.1的沉默效率。如圖8-b所示:與PTY空載相比,PTY-BcGR2.1植株中BcGR2.1的表達量顯著下調,#1、#2、#4和#6植株沉默效率分別是84.2%、72.2%、75%和55.6%。對BcGR2.1基因沉默后植株中的AsA和T-AsA含量進行測定,發(fā)現其AsA和T-AsA含量均顯著下降(圖8-c、d)。用150 μmol·L-1MV(含0.01%吐溫-20)均勻噴灑野生型、PTY空載和PTY-BcGR2.1植株葉片,誘導其產生光氧化脅迫。對以上植株葉片中的H2O2含量進行測定,發(fā)現在光氧化脅迫條件下,BcGR2.1沉默植株葉片中的H2O2含量顯著高于PTY空載(圖8-e)。說明與PTY空載相比,BcGR2.1基因沉默后植株清除體內ROS的能力減弱。

圖8 BcGR2.1基因沉默植株表型(a)、表達量(b)、AsA含量(c)、T-AsA含量(d)以及光氧化脅迫下H2O2含量(e)Fig.8 Phenotype(a),expression level(b),and the contents of AsA(c),T-AsA(d)and H2O2(e)under photooxidativestress in BcGR2.1-silencing plantsPTY:pTY 空載pTY empty carrier;#1、#2、#4、#6:BcGR2.1基因沉默后的植株The plant after BcGR2.1 gene silencing.

3 討論

本研究從不結球白菜中克隆得到BcGR2.1基因,系統進化分析發(fā)現BcGR2.1蛋白與蕪菁同源關系最近,且蛋白保守區(qū)域與其他物種高度相似。丁順華等[12]研究表明,各種GR蛋白的所有底物結合位點甚至整個氨基酸序列都遵循極其保守的進化過程,GR氨基酸序列上相對不保守的區(qū)域通常是一些特定的調控區(qū)域或無催化活性的區(qū)域。在植物細胞中,已報道的一些物種的GR蛋白分布在不同的細胞器中,如植物的細胞質、線粒體、葉綠體以及過氧化酶體中均檢測到了GR活性[3]。研究表明,不結球白菜中存在BcGR1和BcGR2這2種不同亞型的GR,其中BcGR2在葉綠體上表達[11]。在豌豆和煙草等植物中,大部分GR活性(約70%)存在于葉綠體,因此認為葉綠體GR與植物的抗氧化能力密切相關[26]。

由于不結球白菜轉基因過程中再生率和轉化率低,因此本研究通過蘸花法獲得過表達轉基因擬南芥以驗證不結球白菜BcGR2.1基因的功能。在過表達BcGR2.1的擬南芥中,AsA含量顯著高于野生型,說明過表達BcGR2.1能有效提高植物中AsA含量。此外,利用VIGS技術獲得了BcGR2.1沉默的不結球白菜植株,與PTY空載相比,其葉片內AsA含量下降,表明在擬南芥和不結球白菜中,BcGR2.1正向調控AsA含量。

研究發(fā)現,在煙草中過表達GR基因能夠提高其在臭氧和百草枯氧化脅迫下的光合作用[15]。本研究基于BcGR2.1特殊的亞細胞定位和功能,對其在植物應對光氧化脅迫中的作用進行了探索。MV是水溶性二價陽離子,易于擴散至葉綠體內,由于其具有強氧化-還原電勢,在光照條件下能夠從PSⅠ的氧化端接受電子被還原成穩(wěn)定的MV陽離子自由基,再與O2反應形成ROS阻礙光合作用正常進行[19]。本研究發(fā)現,在MV處理模擬的光氧化脅迫下BcGR2.1表達量總體呈現先上升后下降的趨勢,表明光氧化脅迫影響該基因表達量進而對ROS清除產生一定影響。

Tian等[27]研究表明,葉綠素熒光參數ФPSⅡ和Fv/Fm是高溫脅迫條件下植物光合性能的敏感指標,經過高溫脅迫(45 ℃)的煙草葉片Fv/Fm和ФPSⅡ均顯著下降。本研究中,在光氧化脅迫條件下,過表達BcGR2.1擬南芥葉片中的H2O2含量顯著低于野生型,相關葉綠素熒光參數的變化也體現了過表達BcGR2.1擬南芥植株的優(yōu)勢。這說明較高的BcGR2.1表達量能夠一定程度維持光氧化脅迫下植物光合作用正常運行,且與降低H2O2的積累有關。AsA-GSH循環(huán)中各抗氧化酶共同維持主要抗氧化物質的含量和氧化還原比值[28]。本研究中,在光氧化脅迫條件下,編碼AsA-GSH循環(huán)的相關抗氧化酶基因表達量上調,且AtMDHAR2、AtDHAR1、AtDHAR2、AtGPX2以及AtGR1的表達量顯著高于野生型。這說明過表達BcGR2.1擬南芥通過改變AsA-GSH循環(huán)中相關基因的表達量來調節(jié)AsA含量,清除逆境下產生的ROS。此外,BcGR2.1沉默的不結球白菜植株在光氧化脅迫下H2O2的積累量顯著高于PTY空載。

綜上所述,在擬南芥和不結球白菜中BcGR2.1正調控AsA含量,過表達BcGR2.1基因,提高AsA含量,光氧化脅迫條件下過表達轉基因擬南芥體內H2O2含量顯著下降,一定程度上保護了光氧化脅迫下植物的光合功能。這表明BcGR2.1是一種與光氧化脅迫相關的候選基因,能夠提高擬南芥應對光氧化脅迫的耐受力。本研究結果將為進一步鑒定不結球白菜BcGR2基因在抗非生物脅迫中的作用奠定基礎。