采用通用引物PCR技術(shù)檢測(cè)不同類型人乳頭瘤病毒的研究

郭蕊

【摘 要】人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）在人群中感染率較高，并且宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但目前仍缺乏一種簡(jiǎn)單快捷的檢測(cè)方法。本研究選取中國(guó)境內(nèi)常見高毒力HPV病毒，根據(jù)其相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)通用引物GP5和GP6，采用PCR法檢測(cè)各種HPV。研究結(jié)果表明，通用引物GP5和GP6可以檢出HPV-16、18、11、6、52型，但HPV-58、51、31和33型未能檢出。本研究建立的通用引物GP5和GP6已基本涵蓋我國(guó)境內(nèi)高毒力型HPV，具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒；通用引物；PCR

【中圖分類號(hào)】R730 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1672-3783（2018）08-0118-01

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）與許多常見病有關(guān)，該病毒的研究在人群傳播廣泛。大量研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌以及其他腫瘤（包括胃癌、肺癌和食道癌等）均與HPV的感染直接相關(guān)[1]。由于HPV種類繁多，目前確認(rèn)的種類已達(dá)到60余種，其中可以感染人的有6型、11型、16型、18型和33型等十余種型別[2]。

核酸雜交技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction， PCR）是目前檢測(cè)HPV的主要方法，但由于HPV型別復(fù)雜，現(xiàn)有的PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)成本高昂，難以在臨床大規(guī)格推廣。我們借鑒國(guó)外報(bào)道，使用通用引物檢測(cè)HPV感染，取得了較好的效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本

6份不同類型HPV標(biāo)本，采集自本院宮頸糜爛患者宮頸脫落細(xì)胞，采用亞能生物技術(shù)公司HPV分型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)并確定HPV型別。選取攜帶HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型樣本用于本研究。

1.2 試劑和儀器

HPV分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司；分子雜交儀（YH-H16）購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司；2×PCR Master Mix預(yù)混液購(gòu)自南京諾唯贊公司；DNA Marker 2000 bp購(gòu)自上海捷瑞公司；PCR擴(kuò)增儀和凝膠電泳成像分析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；水平電泳套件購(gòu)自上海天能生物公司。

1.3 通用引物合成

根據(jù)HPV基因組高度保守L1序列設(shè)計(jì)通用引物，其序列為：HPV-GP5： TTTGTTACTGTGGTAGATAC和HPV-GP6： GAAAAATAAACTGTAAA TCA。其PCR產(chǎn)物預(yù)測(cè)長(zhǎng)度約150 bp。引物由蘇州泓訊生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括宮頸脫落細(xì)胞DNA模板4 μL，PCR反應(yīng)上下游引物為1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。5μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

采用通用引物進(jìn)行不同類型HPV檢測(cè)后，其產(chǎn)物長(zhǎng)度約150 bp。產(chǎn)物條帶清晰易辨，無(wú)非特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1）。

2.2 通用引物檢測(cè)效果

6種HPV標(biāo)本中，GP5/GP6通用引物可以檢出HPV-16、18、11、6、52型，HPV-58、51、31和33型未能檢出（見圖1）。

3 討論

HPV感染與宮頸癌等腫瘤關(guān)系密切，但目前缺乏HPV病毒的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，HPV-DNA檢測(cè)代替病原學(xué)診斷方法，成為HPV感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。PCR法簡(jiǎn)單方便，成本低廉，是檢測(cè)HPV感染的理想方法。但由于HPV型別眾多，難以尋找到一段保守序列用于引物的設(shè)計(jì)，因此開發(fā)PCR通用引物是檢測(cè)不同型別HPV的唯一方法。

本研究根據(jù)我國(guó)境內(nèi)常見HPV型別，包括HPV-11、16、18、31、33、51、52和58型L1基因序列[3]，選取相對(duì)保守一段序列設(shè)計(jì)通用引物GP5和GP6。并且在PCR擴(kuò)增時(shí)，采用較低的退火溫度以降低PCR反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性，允許引物和目的基因之間存在一定程度錯(cuò)配，以提高擴(kuò)增成功率[4]。我們的檢測(cè)結(jié)果表明，GP5和GP6通用引物可以檢出HPV-16、18、11、6和52型，已基本涵蓋我國(guó)境內(nèi)高毒力型HPV，具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。

在后續(xù)研究中，如需要進(jìn)行HPV型別鑒定時(shí)，可以將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)BALST比對(duì)后即可知道HPV類型。該方法可以節(jié)省大量檢測(cè)費(fèi)用，操作簡(jiǎn)單，更適合于在臨床推廣使用。

參考文獻(xiàn)

[1]Juan C，F(xiàn)eoli-Fonseca JC，Luc L.Human papillomavirus study of 691 pathological specimens from Quebec by PCR-direct sequencing approach [J].J Med Virol，2001，63（4）： 284-292.

[2]Takeshima E，Tomimori K，Kawakami H，etal.NF-κB activation by Helicobacter pylori requires Akt-mediated phosphorylation of p65 [J].BMC Microbiol，2009，9（1）： 36-44.

[3]Chansaenroj J，Theamboonlers A，Junyangdikul P，etal.Whole genome analysis of human papillomavirus type 16 multiple infection in cervical cancer patients[J]. Asian Pacific J Cancer Prev，2012，13（2）：599-606.

[4]Hildesheim A，Schiffman M，Bromley C，etal.Human papillomavirus type 16 variants and risk of cervical cancer[J].J Natl Cancer Inst， 2001， 93： 315-318.

[5]Cornet I，Gheit T，F(xiàn)ranceschi S，etal.The IARC HPV variant study group：human papillomavirus type 16 genetic variants： phylogeny and classification based on E6 and LCR[J].J Virol，2013，86（12）：6855-6861.