禽呼腸病毒S1基因編碼蛋白合成機制研究進展

譚 偉，黃 莉，謝芝勛

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001)

禽呼腸病毒(Avian reovirus,ARV)是沒有囊膜、分節(jié)段的雙鏈RNA病毒,病毒粒子以對稱的二十面體形式存在，直徑約為70 nm～80 nm,成熟的病毒顆粒內(nèi)含有呈線性排列且由10個雙鏈RNA基因節(jié)段組成的病毒基因組[1]。病毒的10個RNA基因片段可分為3類，即L(Large)類、M(Middle)類和S(Small)類。L類RNA的分子質(zhì)量較大，包括病毒基因片段L1、L2和L3。M類RNA的分子質(zhì)量中等，含有基因片段M1、M2和M3。S類RNA基因的分子質(zhì)量較小，由S1、S2、S3和S4共4種RNA分子所組成[1]。ARV的10個RNA基因片段可以編碼病毒的8種結(jié)構(gòu)蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、σA、σB和σC)及4種非結(jié)構(gòu)蛋白(μNS、σNS、p10和p17)[2]。其中，S1基因片段的結(jié)構(gòu)比較特殊，含有3個相互重疊的基因編碼區(qū)，可利用不同的翻譯機制分別合成3種蛋白，即非結(jié)構(gòu)蛋白p10、p17和結(jié)構(gòu)蛋白σC。本文著重介紹禽呼腸病毒S1基因編碼蛋白的合成機制。

1 真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成機制

與其他病毒一樣，ARV也必須借助于易感細胞內(nèi)的蛋白翻譯體系合成病毒自身的蛋白[2]。真核細胞合成蛋白質(zhì)的機制主要包括核糖體掃描翻譯機制、漏過掃描機制、重新啟動翻譯機制及核糖體分路翻譯機制及內(nèi)部起始翻譯機制等[3-4]，不依賴于mRNA。為了便于理解ARV的S1基因片段合成病毒蛋白的機制，下面扼要介紹真核細胞內(nèi)蛋白合成的幾種常見形式。

1.1 核糖體掃描翻譯機制

真核細胞中的mRNA多數(shù)以單順反子存在，主要通過依賴于mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)的核糖體掃描翻譯機制來合成蛋白。一般認為，核糖體40 S小亞基首先與多個蛋白翻譯起始因子相互作用，然后和mRNA 的5′末端帽狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，并沿著mRNA鏈以線性方式，從5′末端向3′末端移動，當遇到第一個蛋白翻譯起始密碼子AUG時，核糖體40 S小亞基與60 S大亞基結(jié)合形成80 S復合物，從而啟動蛋白質(zhì)的翻譯[5]。

1.2 漏過掃描機制

當離mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)最近的AUG所處的堿基序列環(huán)境欠佳時，也就是說與最佳的Kozak序列(A-3CCAUGG+4)有較大差別時，部分40 S小亞基會滑過這個AUG，繼續(xù)向mRNA的3′末端移動，直到遇上合適的蛋白翻譯起始密碼子時才啟動翻譯[3,6]。

1.3 重新啟動翻譯機制

當mRNA含有的第1個蛋白翻譯開放閱讀框(open reading frame,ORF)ORF1翻譯結(jié)束后，核糖體可以繼續(xù)沿著mRNA 向3′末端移動，若遇上ORF2中適宜的AUG密碼子，則可啟動ORF2的翻譯。重新啟動翻譯有兩個必要條件：①ORF1的長度應小于30個密碼子，以避免丟失過多的蛋白翻譯起始因子；②ORF1與ORF2之間的距離應大于70個核苷酸，以使移動的40 S小亞基有足夠的時間重新結(jié)合蛋白翻譯所需的各種必要因子[7]。

1.4 內(nèi)部啟動翻譯機制

此翻譯機制不依賴于mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，但取決于mRNA是否含有內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)。當IRES存在時，40 S小亞基可直接與位于AUG密碼子上游的IRES結(jié)合，當40 S小亞基向下游移動、遇到合適的AUG時，即可啟動蛋白翻譯[8]。這種翻譯模式多見多種病毒，例如，微小RNA病毒、古典型豬瘟病毒、牛病毒腹瀉病毒及丙型肝炎病毒等[2,9-10]。

1.5 核糖體分路翻譯機制

核糖體分路翻譯機制最早見于花椰菜花葉病毒[11]。這種翻譯模式不僅依賴于mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)，同時可通過非線性移動的方式跨越低能量的發(fā)卡結(jié)構(gòu)或多個短小開放閱讀框架(short ORF,sORF)，直接抵達下游所需翻譯的ORF[3]。簡單地說，核糖體首先與mRNA 5′區(qū)域中的供位結(jié)合，經(jīng)非線性遷移到達mRNA 3′區(qū)域內(nèi)的受位；然后沿著mRNA 向3′端繼續(xù)移動，當遇到適宜的AUG時，即可啟動蛋白翻譯程序。此外，靠近mRNA 5′末端的sORF的長度介于2個～10個密碼子時，通過核糖體分路翻譯機制合成蛋白的效率最佳[12]。

2 禽呼腸病毒的p10、p17 及σC蛋白的翻譯機制

在ARV的10個RNA基因節(jié)段中，其中有9個基因片段為單順反子，可以直接利用核糖體掃描翻譯機制合成相對應的病毒蛋白產(chǎn)物。只有S1基因片段較為特殊，為多順反子結(jié)構(gòu)，含有3個相互重疊的ORFs，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白σC及非結(jié)構(gòu)蛋白p10、p17。ARV S1基因中的3個ORF在先后排列次序上具有高度保守性 ，即ORF1(p10基因)接近S1基因的5′末端，ORF2(p17基因)位于S1基因中部，而ORF3(σC基因)則最靠近S1基因的3′末端[13]。

2.1 ARV S1基因的ORF1合成p10蛋白的機制

p10是ARV的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有融合細胞的功能[14]。p10蛋白含有98個氨基酸，分子質(zhì)量10 ku，由S1基因中的ORF1編碼[15]。ORF1的長度為297個核苷酸，其翻譯起始密碼子AUG位于第25-27位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UGA則位于第319-321位核苷酸。

研究表明，Kozak M[16]序列(CCA-3CCAUGG+4)含有蛋白翻譯起始密碼子AUG所需的最佳堿基序列環(huán)境。人們將此序列里AUG中腺苷A的位置定為+1，并證明-3位的腺苷A或鳥苷G及+4位的鳥苷G可直接影響到蛋白翻譯起始的效率。p10基因的蛋白翻譯密碼子AUG周圍的堿基序列為U-3CGAUGC+4。由于此序列的-3位為尿嘧啶核苷U，不是堿基A或G；+4位的堿基為C而不是G，并非最佳的Kozak序列，所以認為p10基因的AUG起始密碼子屬于蛋白翻譯的弱起動子。若將此弱起動子的堿基序列優(yōu)化接近于Kozak序列，即變成A-3CCAUGG+4后，則p10蛋白的表達量可以增加約15倍[17]。ORF1中第25-27位的AUG是S1 mRNA中的第1個起始密碼子，去除S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)會明顯抑制p10蛋白的表達[18]，因此普遍認為ORF1是利用核糖體掃描翻譯機制來合成p10蛋白的。雖然p10蛋白的翻譯起始密碼子AUG最靠近S1 mRNA 5′末端，但由于它是蛋白翻譯的弱起動子，因此在ARV感染細胞中，p10蛋白的表達量較低[18]。

2.2 ARV S1基因的ORF2合成p17蛋白的機制

p17是ARV的非結(jié)構(gòu)蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞周期、激活p53和PTEN蛋白，促進ARV在細胞內(nèi)的繁殖[19-20]。p17蛋白含有146個氨基酸，由S1基因中的ORF2編碼[15]。ORF2的長度為441個核苷酸，其翻譯起始密碼子AUG位于第293-295位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UGA則位于第731-733位核苷酸[13]。此AUG周圍的堿基序列為A-3CAAUGC+4。雖然此序列中的-3位是腺苷A，但-4位卻不是鳥苷G，而是胞嘧啶核苷C。早期的研究認為，+4位的鳥苷G是蛋白翻譯強起動子的基本特征。后來研究發(fā)現(xiàn)+4位的鳥苷G并不像最初認為的那么關(guān)鍵，只有當-3位不是腺苷A時，位于+4位的鳥苷G才對蛋白翻譯的效率有明顯影響。目前認為-3位的嘌呤堿基A或G，特別是腺苷A是蛋白翻譯強起動子的重要特征[21]。所以，p17蛋白的翻譯起始密碼子AUG仍被看成是蛋白翻譯的強起動子[17]。此外，將p10基因蛋白翻譯弱起動子周圍的堿基優(yōu)化為強起動子序列時，p10蛋白的表達增加，而p17蛋白的表達卻明顯減少[17]，提示S1 mRNA中的ORF2是利用漏過掃描機制來合成p17蛋白的。

2.3 ARV S1基因的ORF3合成σC蛋白的機制

σC是禽呼腸病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，氨基酸變異程度最高[22-23]。σC蛋白是ARV編碼的蛋白中唯一能吸附易感細胞的病毒蛋白，并能誘導被感染的細胞發(fā)生死亡[24]，同時σC蛋白是ARV的主要中和抗原，能刺激機體產(chǎn)生抑制病毒繁殖的中和抗體[24]。σC蛋白含有326個氨基酸，分子質(zhì)量約為35 ku，由S1基因中的ORF3編碼[15]。ORF3長度為978個核苷酸，在S1基因的3個ORF中長度最長[25]。σC蛋白翻譯起始密碼子AUG位于第630-632位核苷酸，而蛋白翻譯終止密碼子UAA位于第1 608-1 610位核苷酸[13]。σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG周圍的堿基序列為G-3GGAUGG+4，第-3位和第+4位的堿基均為鳥苷G，屬于最佳的Kozak序列環(huán)境，所以此AUG被視為蛋白合成的強起動子[13,16]。此外，這個AUG起動子與S1基因的5′末端甲基化帽狀結(jié)構(gòu)之間的距離長達600多個堿基。值得注意的是，σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG(630-632 nt)的上游有4個AUG，前2個AUG屬于蛋白翻譯的弱起動子(25-2 nt7,34-36 nt)，而后2個 AUG則屬于強起動子(293-295 nt,298-300 nt)[16]；其中1個弱起動子(25-27 nt)負責編碼p10蛋白，而另外2個強起動子負責分別編碼p17蛋白和σC蛋白[16]。那么，σC蛋白到底是通過什么翻譯機制來合成的呢？理論上有以下3種假設(shè)。

2.3.1 第1種假設(shè)：重新啟動翻譯機制 考慮到編碼p10蛋白的ORF1 和編碼σC蛋白的ORF3之間不存在AUG起始密碼子[13]，一部分40S核糖體在完成p10蛋白的翻譯后，可能會繼續(xù)沿著S1 基因向3′末端移動，當遇到σC蛋白的翻譯起始密碼子AUG時，可重新啟動蛋白翻譯。所以，重新啟動翻譯是σC蛋白合成的可能機制之一。重新啟動翻譯機制通常要求靠近5′末端、被首先翻譯的上游ORF(upstream ORF,uORF)的長度少于30個密碼子[12]，而編碼p10蛋白的ORF1含有98個密碼子，至少3倍于30個密碼子的長度。另外，將ORF1的蛋白翻譯弱起動子AUG周圍的堿基序列優(yōu)化之后，不能顯著提高σC蛋白的表達量。因此，通過重新啟動翻譯機制合成σC蛋白的可能性被排除[17-18]。

2.3.2 第2種假設(shè)：內(nèi)部啟動翻譯模式 此模式認為若一個mRNA含有IRES，則核糖體40S小亞基不需要與mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)相互作用，而能直接與mRNA內(nèi)部的IRES結(jié)合。當40 S小亞基繼續(xù)沿著mRNA 的3′末端向前移動、遇上合適的蛋白翻譯起動子AUG時，就會與60 S核糖體大亞基結(jié)合，開始合成蛋白。由于S1基因mRNA 5′末端的非翻譯區(qū)很短，僅有24個核苷酸，形成RNA二級結(jié)構(gòu)的可能性很小；同時在ORF1與ORF3之間的區(qū)域未發(fā)現(xiàn)莖-環(huán)樣的RNA二級結(jié)構(gòu)，因此，通過內(nèi)部啟動翻譯模式合成σC蛋白的假設(shè)也難以成立[18]。

2.3.3 第3種假設(shè)：促進漏過掃描翻譯模式和非典型的核糖體分路翻譯機制 一些研究人員認為，σC蛋白的合成與IRES結(jié)構(gòu)無關(guān)，但依賴于蛋白翻譯起始因子eIF4G的功能以及S1 mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，并能以非線性移動的方式到達σC蛋白翻譯起始密碼子的上游區(qū)域[18]，通過促進漏過掃描機制合成σC蛋白。另一些試驗數(shù)據(jù)顯示，σC蛋白是以全長的S1 mRNA為模板而合成的，并且σC蛋白翻譯的效率基本上不受uORF的影響。

Racine T等[18]早期提出的假設(shè)認為，核糖體與S1 mRNA的5′末端帽狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，翻譯p10蛋白后，可以通過非線性的移動方式到達σC蛋白的翻譯起始密碼子附近的區(qū)域，啟動σC蛋白的合成。隨后的研究顯示，核糖體能通過兩種不同的、依賴于S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)的模式接近σC蛋白的翻譯起始密碼子[19]。模式一為促進漏過掃描翻譯模式。在此模式中，核糖體能有效通過多個uORF中處于較佳堿基序列環(huán)境的AUGs，靠近σC蛋白的翻譯起始密碼子。模式二為非典型的核糖體分路翻譯機制。此模型不依賴于漏過掃描翻譯機制，相對不受uORF的影響，但仍依賴于S1 mRNA 5′末端的帽狀結(jié)構(gòu)，并需要借助于ORF2中蛋白翻譯增強子(translation enhancer element,TEE)的幫助，將40 S小亞基轉(zhuǎn)送到σC蛋白翻譯起始密碼子上游的區(qū)域[19]。具體來說，與S1 mRNA 5′末端帽狀結(jié)構(gòu)相結(jié)合的40 S小亞基，可繞過1個或幾個uORFs中的AUGs，被直接轉(zhuǎn)移到p17蛋白的翻譯起始密碼子下游的區(qū)域。這種轉(zhuǎn)移過程與ORF2中所含的蛋白翻譯增強子TEE有關(guān)。TEE由27個核苷酸組成，位于S1 mRNA中的第366位和392位核苷酸之間。其中的6個核苷酸(CCCAUC)含有與18 S rRNA互補的堿基序列，能促進40S小亞基以非線性方式轉(zhuǎn)移到σC蛋白翻譯起始密碼子上游區(qū)域。因此，目前一般認為，σC蛋白是通過促進漏過掃描翻譯模式和非典型的核糖體分路翻譯兩種機制進行合成的[19]。

3 結(jié)語

禽呼腸病毒S1 mRNA自身結(jié)構(gòu)中含有能發(fā)揮順式作用的蛋白翻譯增強子TEE，可以通過促進漏過掃描翻譯和非典型的核糖體分路兩種翻譯機制，幫助核糖體接近σC蛋白的翻譯起始密碼子[19]，以便產(chǎn)生適量的σC蛋白。由于ARV的 σC蛋白直接參與病毒吸附易感細胞的早期階段，因此保證σC蛋白的適量表達對ARV進入易感細胞和產(chǎn)生新的子代病毒尤為重要。深入研究涉及S1基因多順反子合成病毒蛋白的影響因素，有助于進一步闡明禽呼腸病毒p10、p17和σC蛋白翻譯的確切機制，幫助發(fā)現(xiàn)調(diào)控這3種病毒蛋白表達的相關(guān)因子，找出抑制ARV在細胞內(nèi)復制繁殖的關(guān)鍵靶位，對研發(fā)抗ARV新藥及ARV疫苗具有重要的理論意義和實際應用價值。

參考文獻:

[1] Benavente J,Martínez-Costas J.Avian reovirus:structure and biology[J].Virus Res,2007,123(2):105-119.

[2] Ryabova L A,Pooggin M M,Hohn T.Viral strategies of translation initiation:ribosomal shunt and initiation[J].Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,2002,72:1-39.

[3] Kozak M.Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes[J].Gene,1999,234:187-208.

[4] Jackson R J,Kaminski A.Internal initiation of translation in eukaryotes:the picornavirus paradigm and beyond[J].RNA,1995,1:985-1000.

[5] Kozak M.The scanning model for translation,an update[J].J Cell Biol,1989,108:229-241.

[6] Kozak M.Context effects and inefficient initiation at non-AUG codons in eukaryotic cell-free translation systems[J].Mol Cell Biol,1989,9:5073-5080.

[7] Kozak M.Constrains on reinitiation of translation in mammals[J].Nucleic Acids Res,2001,29:5226-5232.

[8] Hellen C U,Sarnow P.Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules[J].Genes Dev,2001,15:1593-1612.

[9] Belsham G J,Sonenburg N.Piconavirus RNA translation:roles for celluar proteins[J].Trends Micorbiol,2000,8:330-335.

[10] Tsukiyama-Kohara K,Iizuka N,Kohara M,et al.Internal ribosome entry site within hepatitis C virus RNA[J].J Virol,1992,66:1476-1483.

[11] Futterer J,Gordon K,Sanfacon H,et al.Positive and negative control of translation by the leader of cauliflower mosaic virus pregenomic 35S RNA[J].EMBO J,1990,9:1697-1707.

[12] Pooggin M M,Hohn T,Futterer J.Role of a short open reading frame in ribosome shunt on the cauliflower mosaic virus RNA leader[J].J Biol Chem,2000,275:17288-17296.

[13] Bodelón G,Labrada L,Martínez-Costas J,et al.The avian reovirus genome segment S1 is a functionally tricistronic gene that expresses one structural and two nonstructural proteins in infected cells[J].Virology,2001,290(2):181-191.

[14] Kozak R,Hattin L,Biondi M J,et al.Replication and oncolytic activity of an avian orthoreovirus in human hepatocellular carcinoma cells[J].Viruses,2017, 9(4):90. doi: 10.3390/v9040090.

[15] Xu W,Coombs K M.Conserved structure/function of the orthoreovirus major core proteins[J].Virus Res,2009,144(1-2):44-57.

[16] Kozak M.Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation[J].J Biol Chem,1991,266:19867-19870.

[17] Shmulevitz M,Yameen Z,Dawe S,et al.Sequential partially overlapping gene arrangement in the tricistronic S1 genome segments of avian reovirus and Nelson Bay reovirus:implications for translation initiation[J].J Virol,2002,76(2):609-618.

[18] Racine T,Barry C,Roy K,et al.Leaky scanning and scanning-independent ribosome migration on the tricistronic S1 mRNA of avian reovirus[J].J Biol Chem,2007,282(35):25613-25622.

[19] Kozak M.Point mutations close to the Aug initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulininvivo[J].Nature,1984,308:241-246.

[20] Chiu H C,Huang W R,Liao T L,et al.Suppression of vimentin phosphorylation by the avian reovirus p17 through inhibition of CDK1 and Plk1 impacting the G2/M phase of the cell cycle[J].PLoS One,2016,11(9):e0162356.

[21] Huang W R,Chiu H C,Liao T L,et al.Avian reovirus protein p17 functions as a nucleoporin Tpr suppressor leading to activation of p53, p21 and PTEN and inactivation of PI3K/AKT/mTOR and ERK signaling pathways[J].PLoS One,2015,10(8):e0133699.

[22] Tang Y,Lin L,Sebastian A,et al.Detection and characterization of two co-infection variant strains of avian orthoreovirus (ARV) in young layer chickens using next-generation sequencing (NGS)[J].Sci Rep,2016, 6:24519. doi: 10.1038/srep24519.

[23] Ayalew L E,Gupta A,Fricke J,et al.Phenotypic,genotypic and antigenic characterization of emerging avian reoviruses isolated from clinical cases of arthritis in broilers in Saskatchewan,Canada[J].Sci Rep,2017,7(1):3565. doi: 10.1038/s41598-017-02743-8.

[24] Lu H,Tang Y,Dunn P A,et al.Isolation and molecular characterization of newly emerging avian reovirus variants and novel strains in Pennsylvania,USA,2011-2014[J].Sci Rep,2015,5:14727. doi: 10.1038/srep14727.

[25] Zhong L,Gao L,Liu Y,et al.Genetic and pathogenic characterization of 11 avian reovirus isolates from northern Chinasuggests continued evolution of virulence[J].Sci Rep,2016;6:35271.