基于微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)腸癌病人游離環(huán)狀DNA KRAS突變的新方法

羅宇文，李瑤

復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳學(xué)研究所，上?！?00433

游離循環(huán)DNA (Circulating cell free DNA，cfDNA) 是一種細(xì)胞外游離狀態(tài)的DNA，長(zhǎng)度一般在180 bp左右，腫瘤病人體內(nèi)的cfDNA部分來源于腫瘤細(xì)胞，被稱為循環(huán)腫瘤DNA (Circulating cell free tumor DNA，ctDNA)[1]。理論上，通過檢測(cè)腫瘤病人 cfDNA中腫瘤相關(guān)基因突變應(yīng)與腫瘤組織中含有的基因突變一致，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)腫瘤基因的微創(chuàng)檢測(cè)，即液體活檢，本方法可克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)組織樣本的依賴性等難題[2]。目前，基因突變常用的檢測(cè)方法主要有：直接測(cè)序法、實(shí)時(shí)熒光定量法、高分辨率熔解曲線、質(zhì)譜及高效液相色譜法等[3]。然而，鑒于外周血中cfDNA的豐度較低，其有大量野生型基因背景，故采用傳統(tǒng)方法進(jìn)行檢測(cè)的難度較大。如實(shí)時(shí)熒光定量PCR僅能在野生型背景中檢出30 pg左右的突變；測(cè)序法雖然準(zhǔn)確度更高，但最低只能測(cè)得 1%左右，而且成本較高。

微滴式數(shù)字 PCR (Droplet digital pCR，ddPCR) 是一種同時(shí)具備高靈敏度和高準(zhǔn)確性的PCR檢測(cè)方法，對(duì)于突變檢測(cè)的理論檢測(cè)下限可有效達(dá)到0.001%[4]。其利用油包水原理將PCR反應(yīng)體系分散為數(shù)萬個(gè)微滴，每個(gè)微滴都是一個(gè)單模板PCR反應(yīng)室。模板DNA在微滴中擴(kuò)增后釋放熒光信號(hào)。通過對(duì)每個(gè)微滴熒光信號(hào)的逐一收集來統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增陰性和陽(yáng)性微滴的數(shù)量，并通過泊松分布換算成核酸的初始拷貝濃度，進(jìn)而對(duì)模板初始濃度進(jìn)行精確到單拷貝的定量[5]。微滴內(nèi)的模板拷貝數(shù)為個(gè)位數(shù)而微滴本身的體積極小，所以相對(duì)而言，反應(yīng)體系中低豐度突變基因的相對(duì)豐度很高，因此每個(gè)微滴獨(dú)立檢測(cè)時(shí)的靈敏度會(huì)獲得大幅提升[6]。微滴式數(shù)字PCR可以在擁有更高精確度和結(jié)果穩(wěn)定性的同時(shí)擁有以前分子檢測(cè)方法所無法達(dá)到的檢測(cè)下限 (Limits of detection，LOD)[7]。同時(shí)，多篇文獻(xiàn)證明ddPCR對(duì)于肝素等多種PCR抑制劑都有良好的耐受特性[8-9]，可以避免復(fù)雜體液中可能存在的PCR酶抑制劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，從而提高檢測(cè)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于數(shù)字 PCR的檢測(cè)性能研究較少，所以本文旨在摸索一種基于ddPCR的cfDNA KRAS基因突變檢測(cè)方法，并與現(xiàn)有常規(guī)檢測(cè)方法 (如熒光定量 PCR) 比較線性范圍、LOD、重復(fù)性等，從而為數(shù)字PCR的液態(tài)活檢應(yīng)用提供更多參考與支持。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外同類研究大多都還在使用實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)值與技術(shù)間橫向?qū)Ρ鹊姆椒ㄅ卸`敏度，而沒有使用量化的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，所以本研究基于泊松分布的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行靈敏度分析，對(duì)目前數(shù)字PCR實(shí)用化開發(fā)具有很大的補(bǔ)充完善價(jià)值。其最終目的是為充分挖掘數(shù)字PCR的應(yīng)用潛力，客觀評(píng)價(jià)其檢測(cè)性能，并為其臨床化液態(tài)活檢提供實(shí)踐依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　標(biāo)準(zhǔn)品處理

選擇KRAS基因12和13號(hào)外顯子上7個(gè)突變型作為備選基因，包括G12C、G12V、G12D、G12R、G12S、G12A、G13D，并結(jié)合野生型基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行合成 (寶生物工程 (大連) 有限公司，中國(guó))。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前采用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(寶生物工程 (大連) 有限公司，中國(guó)) 進(jìn)行線性化處理。

1.2　血漿cfDNA的提取

52例結(jié)病患血漿標(biāo)本來自于復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院確診結(jié)直腸癌患者，20例平均年齡 45歲健康人對(duì)照血漿標(biāo)本均來自于鄭州大學(xué)附屬醫(yī)院。按照臨床常規(guī)方法采用無抗凝劑真空采血管采集靜脈血，使用Cell-Free DNA? BCT (218962，Streck Inc. USA) 將5 mL全血以1 600×g速度離心20 min吸取上清得到血漿，再以1 6000×g速度離心10 min去除血漿中的殘留細(xì)胞。在采集分離當(dāng)天使用QIAamp?Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen) 試劑盒進(jìn)行cfDNA提取，核酸特異性結(jié)合到QIAamp Mini離心柱上，污染物流走。通過三步洗滌步驟完全去除二價(jià)陽(yáng)離子和蛋白等PCR抑制物，結(jié)合在離心柱上的純核酸用試劑盒中的洗脫緩沖液洗脫，洗脫體積為 50 μL。在說明書操作流程基礎(chǔ)上，將蛋白酶K處理?xiàng)l件延長(zhǎng)為60 ℃孵育1 h，洗脫體積為30 μL，于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　微滴式數(shù)字PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

基于Beacon Designer 8.10 (Primer Biosoft)軟件 (http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/Beacon-Designer.shtml) 設(shè)計(jì)引物探針，經(jīng) Blast比對(duì)并預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選特異性。引物探針?biāo)槍?duì)的擴(kuò)增子為7種常見KRAS突變基因型與野生型KRAS，在檢測(cè)過程中每一種突變型引物探針都與對(duì)應(yīng)的野生型進(jìn)行雙重檢測(cè)，由于KRAS野生型的cfDNA來源于人類正常組織，所以可以作為KRAS突變檢測(cè)的內(nèi)參使用。所有突變型和野生型使用通用上下游引物 (5′-GACTGAATATAAACT TGTGGTA-3′; 5′-GTCCACAAAATGATTCTGA-3′)，分別針對(duì)每種突變型設(shè)計(jì)FAM標(biāo)記的Taqman探針，并對(duì)于KRAS野生型設(shè)計(jì)HEX標(biāo)記的Taqman探針，具體引物序列如表1所示，所有引物由寶生物工程 (大連) 有限公司化學(xué)合成。

將每個(gè)配制好的 PCR反應(yīng)體系加入微滴發(fā)生卡 (Bio-Rad) 中間一排的8個(gè)“Sample”孔內(nèi)，為保證8個(gè)孔的壓力均一，在PCR反應(yīng)體系不足8個(gè)時(shí)，剩余孔用 20 μL 1×buffer control (Bio-Rad) 補(bǔ)足，加樣時(shí)注意不能產(chǎn)生氣泡。在微滴發(fā)生卡 (Bio-Rad)最底層一排8個(gè)“Oil”孔中各加入70 μL微滴生成油(Bio-Rad)，8孔全部加滿。微滴發(fā)生卡 (Bio-Rad) 通過 QX200? Droplet Generator(Bio-Rad) 儀器制備為20 000個(gè)反應(yīng)微滴，制備完成后微滴位置將處于微滴發(fā)生卡 (Bio-Rad) 頂層一排的8個(gè)“Sample”孔內(nèi)，最后將微滴轉(zhuǎn)移入 96孔板并于普通 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。在PCR過程中，由于微滴本身熱傳導(dǎo)不具備流體一樣的對(duì)流特點(diǎn)，所以為保證微滴間熱傳導(dǎo)更充分，升降溫速度設(shè)定在2.5 ℃/s。PCR反應(yīng)結(jié)束后將96孔板放入QX200? Droplet Reader (Bio-Rad)，并在軟件QuantaSoft (Bio-Rad)上設(shè)定檢測(cè)模式為RED，同時(shí)檢測(cè)FAM和HEX的熒光信號(hào)。儀器會(huì)自動(dòng)分析每個(gè)樣品的每個(gè)微滴中熒光信號(hào)，然后，由QuantaSoft完成對(duì)數(shù)據(jù)的泊松分布換算，獲得靶序列在PCR反應(yīng)體系中的拷貝數(shù)濃度 (單位：copies/μL) 及突變濃度。

表1　微滴式數(shù)字PCR探針序列Table 1　Sequence of digital PCR probes

1.4　聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)引物設(shè)計(jì)及檢測(cè)

參考聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增阻礙突變系統(tǒng) ARMSPCR原理設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物探針，下游使用通用引物，上游引物根據(jù)不同基因型設(shè)計(jì)，并設(shè)計(jì) PNA探針，PNA探針可起到阻遏作用來競(jìng)爭(zhēng)下游提高反應(yīng)的特異性，具體引物序列如表2所示；PNA探針 (野生型) 序列為5′-TGGAGCTGGT GGCGTAGGC-P04-3′，HEX 標(biāo)記的 Taq-man探針序列為 5′-HEX-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAG GCACTCT-BHQ1-3′。

1.5　方法學(xué)論證

1.5.1　cfDNA得率驗(yàn)證

由于 cfDNA的提取得率對(duì)于檢測(cè)靈敏度至關(guān)重要，所以在樣本提取后會(huì)首先檢測(cè)OD260(OD260>1) 以及OD260/OD280(1.6

表2　qPCR引物序列Table 1　Sequence of qPCR primers

1.5.2　理論檢測(cè)性能比較

通過稀釋標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，比較 ddPCR與qPCR的LOD、定量下限 (Limit of quantification，LOQ)、線性范圍、變異系數(shù) (CV%)、特異性、單個(gè)樣品檢測(cè)成本等參數(shù)。

1.5.3　實(shí)際樣本檢測(cè)

使用驗(yàn)證后的ddPCR方法對(duì)臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)及影像學(xué)確診的52例結(jié)直腸癌病人樣本和20例健康人樣本進(jìn)行檢測(cè)。再根據(jù)實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果，比較 ddPCR所得結(jié)果和現(xiàn)有研究中的中國(guó)人群KRAS突變分布比例的一致性，并根據(jù)以上的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果劃定兩種檢測(cè)方法的Cut Off值。

1.5.4　檢測(cè)下限計(jì)算

在任何一種檢測(cè)方式的硬件可接受動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，檢測(cè)背景 (Limit of blank，LOB)、LOD、LOQ的范圍在依次排開，具體關(guān)系如圖1所示。其中，濃度低于 LOB的樣本無法測(cè)得陽(yáng)性，濃度高于LOB但低于 LOD的樣本無法穩(wěn)定檢出但檢出有可能為陽(yáng)性，需要重復(fù)檢測(cè)；濃度高于LOD低于LOQ的樣本可穩(wěn)定檢出但無法精確定量，高于LOD即可出具可靠的臨床報(bào)告；濃度在LOQ范圍內(nèi)的樣本可以達(dá)到精確定量檢測(cè)的目的；高于LOQ低于總動(dòng)態(tài)范圍的樣本可以判定陽(yáng)性但定量誤差較大；大于動(dòng)態(tài)范圍濃度的樣本將表現(xiàn)出過飽和陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，無法定量。LOD作為區(qū)分方法學(xué)能否可靠檢出結(jié)果的分水嶺，是檢測(cè)方法最重要的一項(xiàng)參數(shù)，直接關(guān)系到臨床報(bào)告的可靠性。而LOD的值等于該檢測(cè)方法假陽(yáng)性水平的正向95%統(tǒng)計(jì)學(xué)分位數(shù)，所以我們可以通過估計(jì)陰性臨床樣本的假陽(yáng)性水平來計(jì)算 LOD，并以LOD來定義靈敏度。

圖1　檢測(cè)方法動(dòng)態(tài)范圍關(guān)系圖Fig. 1　Dynamic range schematic of diagnostic method.

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS v21.0 (http://spss.en.softonic.com/) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，qPCR計(jì)量資料以正態(tài)分布均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，ddPCR計(jì)量資料以泊松分布的數(shù)學(xué)期望顯示。由于正態(tài)分布與泊松分布間、Ct值結(jié)果與拷貝數(shù)結(jié)果間不能以常規(guī)檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)差異顯著性，故以某一估計(jì)總體的數(shù)學(xué)期望值/均值是否處于另一估計(jì)總體的95%置信區(qū)間外來衡量差異是否顯著。

2　結(jié)果

2.1　ddPCR理論性能檢測(cè)

經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化成功建立了基于ddPCR 7個(gè)位點(diǎn)的KRAS檢測(cè)方法 (反應(yīng)體系及反應(yīng)條件)。為驗(yàn)證反應(yīng)特異性，以非特異模板進(jìn)行不同突變型引物探針間的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。不同突變型之間、突變型與野生型之間的交叉反應(yīng)為零。標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)中的特異性為100%。

如圖2A和2B所示，ddPCR檢測(cè)中平均每孔微滴數(shù)超過10 000個(gè)，由于微滴中平均包裹核酸拷貝數(shù)符合泊松分布，而10 000個(gè)以上的微反應(yīng)單位已經(jīng)達(dá)到進(jìn)行數(shù)字PCR泊松分布分析的最小抽樣量[10]。如圖2所示，G12C與G12D最低測(cè)得濃度為 0.01%，其余突變型測(cè)得最低濃度為0.04%。所有基因型 0.1%及以上濃度的 CV都小于 25%，使用標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)過程中突變含量 0%的樣品都沒有出現(xiàn)假陽(yáng)性，線性方程的R2都大于0.98，圖3為各檢測(cè)位點(diǎn)的線性曲線。

2.2　健康人樣本的ddPCR檢測(cè)及理論LOD值

使用 20個(gè)健康人樣本作為陰性對(duì)照進(jìn)行ddPCR檢測(cè)，在檢測(cè)中大部分結(jié)果都顯示陰性(圖4)，各突變類型的總反應(yīng)體系中假陽(yáng)性結(jié)果都小于2 copies/μL，假陽(yáng)性孔中的陽(yáng)性微滴數(shù)量為1–2 droplets。

本研究中ddPCR的理論LOD值依據(jù)兩種準(zhǔn)則建立：一種是以泊松分布在采樣量極大時(shí)無限接近正態(tài)分布的原理，假設(shè)陰性對(duì)照的假陽(yáng)性結(jié)果符合正態(tài)分布，將其LOD判定在假陽(yáng)性結(jié)果均數(shù)的正態(tài)分布95%置信區(qū)間以外 (LOD判定法1)。另一種是依據(jù)于 ddPCR中陽(yáng)性微滴符合泊松分布，通過公式FPR=false droplets number/wells來計(jì)算不同方法的假陽(yáng)性率 (False positive rate，F(xiàn)PR)，并以FPR的泊松分布正向95%置信區(qū)間分位數(shù)為真陽(yáng)性閾值 (微滴數(shù))[11]，同時(shí)以真陽(yáng)性閾值作為 LOD的負(fù)方向 95%置信區(qū)間分位數(shù)來推測(cè)LOD的數(shù)學(xué)期望值 (LOD判定法2)，具體判定結(jié)果見表3，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)更高、結(jié)果更保守的LOD判定法2。

圖2　ddPCR擴(kuò)增微滴圖 (以G12D標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋檢測(cè)結(jié)果為例). (A) ddPCR擴(kuò)增微滴一維圖，Ch1為FAM通道 (突變型)，Ch2為HEX通道 (野生型). 黑灰色微滴為無擴(kuò)增陰性微滴，藍(lán)色和綠色微滴分別為FAM和HEX通道中PCR陽(yáng)性擴(kuò)增微滴，突變比例從左至右依次降低. (B) ddPCR擴(kuò)增微滴二維圖，縱軸為FAM熒光增量，橫軸為HEX熒光增量，微滴在坐標(biāo)系內(nèi)聚類為4簇：左下為無模板微滴，左上為僅有FAM信號(hào)的微滴，右下為僅有HEX信號(hào)的微滴，右上為同時(shí)發(fā)出FAM與HEX信號(hào)的雙陽(yáng)性微滴.Fig. 2　ddPCR amplification chart (G12D as an example). (A) ddPCR 1D amplification charts,Ch1 is FAM Channel(mutant type) and Ch2 is HEX channel (wild type). In these charts,black points signify PCR negative droplets,blue and green points respectively signify PCR positive droplets in FAM channel and HEX channel,the mutation abundances descend from left to right. (B) ddPCR 2D amplification chart,Y axis shows amplitude in FAM channel and X axis shows amplitude in HEX channel,the droplets are separated in 4 clusters: lower left points signify no template droplets,upper left points signify the FAM signal positive droplets,lower right points signify HEX signal positive droplets,upper right points signify double positive droplets in both FAM and HEX channel.

圖3　KRAS基因不同突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (A) KRAS基因G12C突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (B) KRAS基因G12D突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (C) KRAS基因G12A突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (D) KRAS基因G12V突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (E) KRAS基因G12R突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (F) KRAS基因G12S突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. (G) KRAS基因G13D突變型標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋線性方程圖. G12D及G12C的濃度梯度為100%–0.01%，10倍稀釋；其余突變型的稀釋梯度為1%、0.2%、0.1%、0.04%Fig. 3　ddPCR linear curves of KRAS mutant abundances. (A) shows linear curve of KRAS G12C type. (B) shows linear curve of KRAS G12D type. (C) shows linear curve of KRAS G12A type. (D) shows linear curve of KRAS G12V type. (E) shows linear curve of KRAS G12R type. (F) shows linear curve of KRAS G12S type. (G) shows linear curve of KRAS G13D type. The samples of G12D and G12C are tenfold diluted from 100% to 0.01%,the dilution gradients of other mutant types are 1%,0.2%,0.1% and 0.04%.

圖4　陰性對(duì)照檢測(cè)的微滴一維圖Fig. 4　1D droplets chart of negative control tests.

表3　兩種不同方法判定的ddPCR KRAS突變檢測(cè)法的LODTable 3　LODs of ddPCR KRAS detection evaluated by 2 different algorithms

由于QX200 ddPCR儀的微滴上限為20 000個(gè)，而微滴體積為0.89 nL，每個(gè)反應(yīng)體系20 μL，所以當(dāng)陽(yáng)性微滴數(shù)已知時(shí)可以通過泊松分布校正公式copies/μL=20·(–ln(1–PD/20 000))/0.89計(jì)算反應(yīng)體系中的總拷貝數(shù)，式中 PD代表反應(yīng)中的陽(yáng)性微滴數(shù)。當(dāng)LOD=3 positive droplets/well時(shí)，對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為3.49拷貝，鑒于QX200 ddPCR的理論檢測(cè)上限為100 000拷貝，定量比較精確的結(jié)果為低于其總微滴數(shù)的20 000拷貝左右，所以當(dāng)反應(yīng)體系中野生型對(duì)照達(dá)到20 000拷貝時(shí) (上樣量足夠)，3.49拷貝對(duì)應(yīng)的突變含量為0.017%。由于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析最低可檢測(cè)突變含量低于線性梯度稀釋實(shí)驗(yàn)中的最低值 0.01%及 0.04%，且該濃度下測(cè)定值CV<25%，所以有理由確認(rèn)數(shù)字PCR在KRAS檢測(cè)中的突變含量LOD為0.01%–0.04%左右。

2.3　實(shí)時(shí)定量PCR理論性能檢測(cè)

如圖 5所示，非特異模板無擴(kuò)增曲線或Ct>35，空白對(duì)照無擴(kuò)增。最低測(cè)得 0.1%突變含量的樣本，Ct值變異系數(shù)在12%以內(nèi)，如果按每個(gè)Ct濃度差異2倍來估算的話，定量的變異系數(shù)約為50%左右。由于qPCR需以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值為參照，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以對(duì)樣品定量 (定量結(jié)果都以已知量標(biāo)定)，所以定量誤差無法在標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)中體現(xiàn)。而對(duì)于樣品檢測(cè)而言，精度除受Ct值誤差影響以外，完全依賴于建立方法所用標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量及其稀釋準(zhǔn)確度。

2.4　健康人樣本的實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)及理論LOD值

使用 16個(gè)健康人樣本作為陰性對(duì)照進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，多數(shù)無擴(kuò)增，Ct值記為50，少部分有Ct值高于40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增曲線，以Ct值置信區(qū)間作為判定實(shí)時(shí)定量PCR LOD的方法。如表4所示，在上樣量不變的情況下，由于LOD值小于0.1%濃度樣本的Ct值，因此，G12S并無法可信地判定0.1%突變?yōu)檎骊?yáng)性。

圖5　qPCR濃度梯度Ct值曲線Fig. 5　Ct/concentration gradient curve of qPCR.

表4　qPCR法在各突變檢測(cè)位點(diǎn)的理論LOD (Ct值)Table 4　The oretical LODs of qPCR methods in all mutant type (Ct value)

2.5　誤差與重復(fù)性

圖6為綜合分析比較ddPCR與qPCR在LOQ內(nèi)所有測(cè)得值CV的結(jié)果，ddPCR在所有突變含量下的CV水平都要低于qPCR，證明其重復(fù)性更好且精確性更高。

2.6　ddPCR實(shí)際樣本檢測(cè)結(jié)果

首先使用 ddPCR方法對(duì)所有樣本的 7種KRAS突變位點(diǎn)做了一次檢測(cè)，然后對(duì)于測(cè)得結(jié)果低于理論LOD值的樣本提高1倍上樣量，提高核酸絕對(duì)量并重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)后測(cè)得為陰性突變結(jié)果和低于理論LOD值的樣本記為純野生型。所有測(cè)得拷貝數(shù)濃度都除以PCR體系稀釋比得到原始濃度，并將突變型除以總cfDNA拷貝數(shù)得到突變含量 (表5)。低于LOD及難以確認(rèn)的樣本，增加1倍上樣量重復(fù)驗(yàn)證，并參考腫瘤手術(shù)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果及帕尼單抗耐藥情況進(jìn)行驗(yàn)證。

圖6　ddPCR與qPCR變異系數(shù)對(duì)照?qǐng)DFig. 6　Comparison of variable coefficients between ddPCR and qPCR. X axis shows.

表5　基于ddPCR測(cè)得臨床樣本KRAS野生型、突變型拷貝數(shù)換算出的突變含量Table 5　Clinical sample mutation abundances calculated from ddPCR detection results of KRAS wild and mutant type copy numbers

續(xù)表5

在所有52例臨床樣本364個(gè)反應(yīng)的檢測(cè)中，如以2.2中的LOD進(jìn)行判定，需重復(fù)驗(yàn)證的結(jié)果總共47個(gè)反應(yīng)，驗(yàn)證后，其中假陽(yáng)性44反應(yīng)，假陰性3反應(yīng)。如果以靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)) 計(jì)算臨床靈敏度，以特異性=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))，則臨床靈敏度為97.64%，臨床特異性為81.43%。

2.7　cfDNA提取得率

本次研究 cfDNA提取效率通過野生型突變型拷貝數(shù)總量計(jì)算 (圖 7)，平均提取效率為5.19 ng/mL。測(cè)得結(jié)果相比OD260比色結(jié)果更低，但數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，我們認(rèn)為這主要是由于樣品內(nèi)雜質(zhì)干擾了比色定量的結(jié)果，故采用 ddPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)。

依據(jù)泊松分布原理，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果落在其95%置信區(qū)間內(nèi)，樣本總量中則至少擁有 3個(gè)拷貝以上的目的基因。對(duì)20 000個(gè)微滴中的DNA分子來說，如果要測(cè)得0.1%的突變，則模板量必須達(dá)到3 000個(gè)拷貝野生型DNA中含有3個(gè)拷貝的突變型DNA，本研究中將此稱為液態(tài)活檢的樣本極限 LOD。以本次提取效率估計(jì)，采血量與LOD相關(guān)表格見表6。

圖7　本研究中52個(gè)結(jié)直腸癌病人血液cfDNA提取效率Fig. 7　Blood cfDNA extraction efficiency of 52 colorectal cancer patients’ sample in this study.

表6　以本次研究結(jié)果建立的采血量與樣本極限LOD關(guān)系表Table 6　Relationship between total blood capacity and sample LOD according to the result of this study

3　討論

KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族，是EGFR信號(hào)通路中的重要基因之一，位于染色體 12p12.1上，編碼p21蛋白[12]。其突變型不依賴刺激信號(hào)的激活，即不受上游EGFR基因狀態(tài)的影響，始終處于激活狀態(tài)，其功能狀態(tài)不可控，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖。在大約38%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中都發(fā)生了 KRAS突變，其中>96%的突變發(fā)生在12–13號(hào)密碼子上[13]。由于KRAS突變后不再依賴于其他信號(hào)的調(diào)控，這會(huì)導(dǎo)致抗EGFR靶向藥物或者EGFR抑制劑在癌癥治療中失效[14]，并對(duì)西妥昔單抗等藥物的治療效果產(chǎn)生重大影響。已有研究表明，中國(guó)結(jié)直腸癌患者中，KRAS的突變頻率為30%–40%左右，和世界人群一樣，中國(guó)結(jié)直腸癌患者的 KRAS突變中主要包括 12號(hào)及13號(hào)外顯子上的 7種突變[15]。通過檢測(cè) KRAS突變可對(duì)癌癥進(jìn)行及時(shí)的偵測(cè)及預(yù)后，并能基于個(gè)體化用藥原則對(duì)治療方案進(jìn)行指導(dǎo)?，F(xiàn)在很多的腫瘤基因檢測(cè)都是使用腫瘤組織的石蠟包埋塊作為 DNA模板來源，雖可準(zhǔn)確地檢出腫瘤組織中癌癥相關(guān)突變，但要獲取腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)面臨兩個(gè)難題。首先一些腫瘤組織并不便于使用傳統(tǒng)的穿刺或手術(shù)方法獲得；其次，獲取腫瘤組織本身對(duì)患者的身體都會(huì)帶來創(chuàng)傷。除此之外，雖然獲得了腫瘤組織，但腫瘤組織的包埋過程、保存狀態(tài)及腫瘤細(xì)胞個(gè)體的異質(zhì)性都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。

液態(tài)活檢最早于1974年由Sorrells RB應(yīng)用關(guān)節(jié)腔的滑液分析來診斷滑膜疾病[17]。結(jié)合當(dāng)下的核酸、細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，液態(tài)活檢這個(gè)概念近期被重新提出，其專注方向開始偏向于血液中的游離循環(huán)核酸 (DNA和RNA) 和循環(huán)腫瘤細(xì)胞。液態(tài)活檢也由一種概念和技術(shù)迅速發(fā)展成為腫瘤生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并逐步由實(shí)驗(yàn)室研究步入臨床應(yīng)用階段[18]。液態(tài)活檢中的液態(tài)指的是體液樣本，其中包括了血液、胸水、腹水、腦脊液、尿液及其他體液等，其檢測(cè)對(duì)象主要有兩大類：一類是核酸、另一類是細(xì)胞，對(duì)于體液中的cfDNA檢測(cè)正屬于其中的一類。液態(tài)活檢在臨床療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷及臨床分期、腫瘤個(gè)體化治療靶標(biāo)等方向提供了一條微創(chuàng)檢測(cè)的途徑。相較于傳統(tǒng)的組織活檢或固相活檢，體液從臨床獲得樣本途徑非常簡(jiǎn)便，可以做到隨時(shí)取樣、隨時(shí)監(jiān)測(cè)，也不會(huì)造成醫(yī)源性播散[19]。同時(shí)有研究表明，通過對(duì)于游離核酸液態(tài)活檢方法得到的突變含量相比于熒光原位雜交 (FISH)等基于腫瘤組織的檢測(cè)方法來說，和腫瘤的死亡率等指標(biāo)擁有更一致的聯(lián)系[20]。已有文獻(xiàn)表明在使用TKI藥物的非小細(xì)胞肺癌的伴隨診斷中，使用 ddPCR進(jìn)行液態(tài)活檢，其可靠性高于傳統(tǒng)方法[21-22]。

在本研究理論檢測(cè)性能驗(yàn)證中，ddPCR理論拷貝數(shù) LOD為 3.49 copies/well，理論突變濃度LOD達(dá)到0.01%–0.04%。線性范圍內(nèi)R2良好，定量誤差在25%以內(nèi)。

將qPCR的Ct值轉(zhuǎn)化為突變濃度百分比，以其正態(tài)分布與ddPCR的LOD及LOQ的泊松分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。則ddPCR在LOD推算的靈敏度上比 qPCR高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，定量變異系數(shù)低于qPCR，線性范圍也比qPCR更廣 (P<0.05)，從而可以得到更精準(zhǔn)更靈敏的理論檢測(cè)性能。同時(shí)，ddPCR相比ARMS PCR等方法可方便地進(jìn)行雙重PCR，以野生型基因拷貝數(shù)作為內(nèi)參來提高突變濃度的定量準(zhǔn)確度。ddPCR對(duì)于拷貝數(shù)的絕對(duì)定量原理，使其檢測(cè)性能不再受制于擴(kuò)增曲線、Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)品的限制。

在本次實(shí)驗(yàn)的臨床樣本檢測(cè)結(jié)果中，可確認(rèn)的真陽(yáng)性樣本最低濃度為0.06%，在LOD以上的檢測(cè)范圍中重復(fù)性較好。從技術(shù)角度來看，ddPCR技術(shù)可以滿足現(xiàn)有癌癥液態(tài)活檢的需求，且檢測(cè)性能優(yōu)于 qPCR。在實(shí)際使用中，ddPCR測(cè)得病人樣本中的KRAS平均突變率為35.43%，接近現(xiàn)有報(bào)道中的中國(guó)結(jié)直腸癌人群中的突變率 (38%左右)，結(jié)果無顯著差異 (P>95)。而具體突變位點(diǎn)的的比例則差異很大 (P<0.05)，筆者認(rèn)為這主要是因?yàn)?2例樣本的取樣量有限，無法完全體現(xiàn)總體分布，同時(shí)也受方法學(xué)之間差異的影響。在對(duì)臨床樣本檢測(cè)結(jié)果重復(fù)驗(yàn)證后得到的臨床靈敏度為97.64%，臨床特異性為81.43%。

本次研究的平均 cfDNA提取效率均一性相差很大。這一方面是在樣本保存和運(yùn)輸過程中導(dǎo)致的，另一方面也可能由于樣本間個(gè)體差異導(dǎo)致的。提取效率的不均一性直接導(dǎo)致了樣本間靈敏度的差異，所以對(duì)于液態(tài)活檢領(lǐng)域，樣本提取的方法學(xué)研究和標(biāo)準(zhǔn)化同樣十分重要。對(duì)于突變含量的檢測(cè)靈敏度不僅取決于核酸絕對(duì)量的檢測(cè)靈敏度，還受到提取所得cfDNA總量的影響。所以在標(biāo)定ddPCR對(duì)于cfDNA檢測(cè)的Cut Off值時(shí)，首先，應(yīng)當(dāng)將ddPCR對(duì)于目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)的LOD作為判定Cut Off值的基礎(chǔ)；同時(shí)，Cut Off值和實(shí)際靈敏度是隨著反應(yīng)體系內(nèi)的 cfDNA總量變化的。

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