PDGF-B免疫原的制備及其腹水抗體對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

范修德，李娜，王西強(qiáng)，孫文剛，李倩，李漢超，王小云，賈皚

1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，陜西 西安　710061

2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，陜西 西安　710061

3 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 西安　710061

4 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安　710061

5 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安　710061

肝細(xì)胞癌 (Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，有較高的發(fā)病率和死亡率，由于起病隱匿、病情發(fā)展迅速、較高的手術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率等特點(diǎn)，臨床治療效果并不理想[1-2]。但是隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)的分子和細(xì)胞機(jī)制逐漸被認(rèn)識(shí)，生長(zhǎng)因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已引起人們的極大關(guān)注，阻斷生長(zhǎng)因子與其受體的相互作用可能在腫瘤的治療方面取得一定療效[3-4]。

血小板衍生生長(zhǎng)因子 (Platelet-derived growth factor PDGF) 是 30多年前從人的血小板中分離出來的肽類生長(zhǎng)因子，主要包括4種不同的多肽鏈：PDGF-A、B、C、D[5]。四種 PDGF多肽鏈通過二硫鍵的連接形成同型或異型二聚體，與血小板衍生生長(zhǎng)因子受體 (Platelet-derived growth factor receptor PDGFR) 結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[6]。Doolittle等發(fā)現(xiàn)PDGF-B鏈基因與猴肉瘤病毒的癌基因v-sis有92%的同源性，PDGF-B與p28V-sis結(jié)構(gòu)的相似性表明，PDGF-B可能通過與膜上的受體結(jié)合，激活相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變[7]。在 5種不同的二聚體亞型PDGF-AA、PDGFAB、PDGF-BB、PDGF-CC 和PDGF-DD中，PDGF-BB是肝間質(zhì)細(xì)胞分泌的最主要的二聚體結(jié)構(gòu)，是唯一能與3種PDGF受體PDGFR-αα、PDGFR-αβ 及 PDGFR-ββ 均可結(jié)合的分子，也是目前與配體特異性結(jié)合位點(diǎn)研究最為清楚的分子[8]。正常肝臟僅表達(dá)少量的PDGF-B，但是在肝纖維化發(fā)生時(shí)PDGF-B的表達(dá)水平明顯提高，研究發(fā)現(xiàn)PDGF-B轉(zhuǎn)基因小鼠在6個(gè)月內(nèi)可以自發(fā)性地發(fā)生肝纖維化，而且PDGF-B的轉(zhuǎn)基因小鼠在二乙基亞硝胺 (Diethylnitrosamine，DEN) 誘導(dǎo)下，較非轉(zhuǎn)基因小鼠更早發(fā)生HCC，而且腫瘤進(jìn)展更快[9]。這些研究均提示PDGF-B與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷PDGF-B可能在HCC的治療方面取得一定療效。

因此本課題組將 hPDGF-B分子中與其生物學(xué)活性密切相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域插入到融合表達(dá)載體pET28-Trx中，構(gòu)建符合讀框的融合基因，將表達(dá)并純化的重組蛋白作為免疫原，主動(dòng)免疫小鼠，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)hPDGF-B的特異性抗體，觀察其對(duì)人 HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，為PDGF-B疫苗的構(gòu)建及 HCC治療探索新的可行途徑。

1　材料與方法

1.1　菌種、質(zhì)粒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

E. coliBL21(DE3)、pGEM-T載體、pET-28a(+)質(zhì)粒、pET-28a-Trx質(zhì)粒、人肝癌細(xì)胞系 HepG2均為本實(shí)驗(yàn)室保存；雄性昆明小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2　主要試劑

限制性內(nèi)切酶 (PstⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和NdeⅠ)、T4 DNA連接酶、PCR引物、質(zhì)粒DNA試劑盒、膠回收試劑盒均購自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、DMSO、CCK8、胰蛋白酶購自Sigma公司；人重組細(xì)胞因子 PDGF-BB購自 R&D公司；pET28-PDGF-B重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并表達(dá)；His-tag抗體購自Abcam公司；HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自EarthOx公司。

1.3　引物設(shè)計(jì)

利用Primer5軟件設(shè)計(jì)hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列引物，引物序列見表1。引物由TaKaRa公司合成。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s) 表示；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)法；采用單因素方差分析 (One Way ANOVA) 對(duì)多組樣本均數(shù)進(jìn)行比較。

1.5　hPDGF-B免疫原的制備

1.5.1　hPDGF-B抗原表位的預(yù)測(cè)

通過閱讀文獻(xiàn)和利用 B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)軟件(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/predict.htmL在線預(yù)測(cè))，針對(duì)hPDGF-B與PDGFR作用的位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了兩段16個(gè)氨基酸的短肽，即VFEISRRLIDRTNANF(16AA，103位到118位)和QVRKIEIVRKKPIFKK(16AA，152位到167位)，標(biāo)記為hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167。

1.5.2　hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167編碼序列的克隆

采用PCR技術(shù)以正常人的基因組cDNA為模板分別擴(kuò)增hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列，DNA引物序列見表1。其中 hPDGF-BΔ103-118 1F和 hPDGF-BΔ152-167 1F 的 5′端分別引入PstⅠ酶切位點(diǎn)，hPDGF-BΔ103-118 1R和hPDGF-BΔ152-167 1R的3′端分別引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為65 bp。

表1　hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列的引物核苷酸序列表Table 1　Primers used for expanding hPDGF-BΔ103-118 and hPDGF-BΔ152-167

1.5.3　hPDGF-BΔ103-118和 hPDGF-BΔ152-167原核表達(dá)載體的構(gòu)建

上述擴(kuò)增產(chǎn)物即特異 hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167基因片段經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，與pGEM-T載體連接，經(jīng)克隆篩選、PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序鑒定 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司)。挑選陽性克隆，pGEM-T/hPDGF-BΔ103-118和pGEM-T/hPDGF-BΔ152-167以PstⅠ和BamHⅠ雙酶切，切膠純化回收后，與同樣處理的pET28-Trx表達(dá)載體在T4 DNA連接酶的作用下，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α擴(kuò)增，NdeⅠ+XhoⅠ雙酶切消化4 h，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和基因測(cè)序，檢測(cè)兩種重組質(zhì)粒的正確性。

1.5.4　重組蛋白的原核表達(dá)及純化

挑取pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167陽性E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌克隆，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE鑒定，觀察有無目的條帶；大量誘導(dǎo)表達(dá)的 pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白分別通過Ni-NTA純化，純化后蛋白分別簡(jiǎn)寫為6×his TrxhPDGF-BΔ103-118重組蛋白和6×his Trx-hPDGFBΔ152-167重組蛋白。

1.6　hPDGF-B抗體的制備及純化

1.6.1　動(dòng)物免疫

將4周齡的昆明種雄性小鼠15只，隨機(jī)分成6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白免疫組、6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫組及對(duì)照組各5只；將透析好的兩種hPDGF-B重組蛋白分別與弗氏完全佐劑按1∶1比例混合，充分混勻至完全乳化，腹腔注射相應(yīng)蛋白混合物0.2 mL，對(duì)照組注射 PBS溶液 0.2 mL；2周后，將兩種hPDGF-B重組蛋白分別與弗氏不完全佐劑按 1∶1比例混合，完全乳化后每只小鼠注射0.2 mL，對(duì)照組注射PBS溶液0.2 mL，每2周免疫一次；以后每隔1周通過斷尾靜脈采血的方法，以ELISA法測(cè)定hPDGF-B抗體滴度。

1.6.2　ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)

原核表達(dá)的 PDGF-B重組蛋白定量后按20 ng/孔包被96孔酶標(biāo)板，封閉后將上述鼠尾血清用10%的牛血清/PBST稀釋液按一定的比例稀釋后，第一孔稀釋比為1∶200，依次倍比稀釋，最后一孔為陰性對(duì)照，以HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗 (1∶5 000) 進(jìn)行檢測(cè)，孵育后各孔依次加入底物A液和顯色B液各1滴，5 min向各反應(yīng)孔中加入終止C液1滴，觀察各孔顏色并記錄抗體滴度。

1.6.3　hPDGF-B多克隆抗體腹水的制備和純化

注射小鼠H22肝癌細(xì)胞前，6×his Trx-hPDGFBΔ103-118重組蛋白免疫組及 6×his Trx-hPDGFBΔ152-167重組蛋白免疫組的抗體滴度需達(dá)1∶8 000以上；用生理鹽水稀釋H22細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL；將H22細(xì)胞懸液按0.5 mL/只的劑量注入免疫過的小鼠腹腔；注入H22細(xì)胞后7 d左右，小鼠體重逐漸停止增加，腹腔明顯膨隆，行動(dòng)遲緩，皮毛無光澤，對(duì)照組小鼠精神及一般狀態(tài)均正常。取小鼠眼血后將小鼠處死抽取腹水，獲得PDGF-B多抗血清及多抗腹水，間接 ELISA檢測(cè)小鼠抗體滴度，而后用雙層濾紙過濾腹水；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清，精確定量腹水體積；采用辛酸硫酸銨法純化腹水抗體，取少量純化后的抗體適當(dāng)稀釋后，ELISA方法檢測(cè)純化腹水抗體效價(jià) (方法同前)。

1.6.4　Western blotting法驗(yàn)證純化腹水抗體與PDGF-B的結(jié)合能力

收集的純化腹水經(jīng)過ELISA檢測(cè)含有高滴度的抗體，還需驗(yàn)證其與PDGF-B的結(jié)合能力，上樣蛋白選擇pET28-PDGF-B重組蛋白，通過制樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用10 %的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗 Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體(1∶500)，Anti-hPDGF-BΔ152-167純化腹水抗體( 1∶500) 及 His-tag 抗體 (1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，分別加入二抗山羊抗小鼠IgG (1∶10 000) 于37 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，采用超靈敏多功能成像儀 (美國GE Amersham Imager 600；型號(hào)AI600) 采集蛋白條帶圖像。

1.7　hPDGF-B抗體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

1.7.1　PDGF-BB對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板，每孔加 150 μL，周圍孔則加入PBS，置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)分組：①無血清DMEM組；②1 ng/mL PDGF-BB組；③ 2 ng/mL PDGF-BB組；④4 ng/mL PDGF-BB組；⑤ 8 ng/mL PDGF -BB組；⑥16 ng/mL PDGF-BB組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞接種24 h后，按照分組分別加入不同培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1–2 h；在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，重復(fù)CCK-8實(shí)驗(yàn)3次，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7.2　hPDGF-B抗體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)合上一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PDGF-BB濃度在4 ng/mL對(duì)HepG2細(xì)胞促增殖能力最強(qiáng)，故PDGF-BB濃度定為4 ng/mL；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加150 μL，周圍孔則加入PBS，置于37 ℃、含5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)分組：①無血清DMEM組；② 4 ng/mL PDGF-BB組：培養(yǎng)液中加入hPDGF-BB 4 ng/mL；③Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體組 (1∶10始，4倍系列稀釋)；④PDGF -BB＋Anti-hPDGF-BΔ103-118純化腹水抗體組 (培養(yǎng)液中同時(shí)加入PDGF-BB 4 ng/mL和3種不同稀釋度 (1∶10始，4倍系列稀釋) 的小鼠PDGF-B純化腹水抗體)；⑤Anti-hPDGF-BΔ152-167純化腹水抗體組 (1∶10始，4倍系列稀釋)；⑥PDGF -BB＋Anti-hPDGF- BΔ152-167純化腹水抗體組 (培養(yǎng)液中同時(shí)加入PDGF-BB 4 ng/mL和3種不同稀釋度 (1∶10始，4倍系列稀釋) 的小鼠 PDGF-B純化腹水抗體)；⑦3種不同稀釋度(1∶10始，4倍系列稀釋) Trx抗體組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；細(xì)胞接種24 h后，按照分組分別加入不同培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1–2 h；在酶標(biāo)儀上測(cè)量各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，重復(fù)CCK-8實(shí)驗(yàn)3次，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞增殖曲線。

2　結(jié)果與分析

2.1　pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118 和 pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用PCR技術(shù)以正常人的基因組cDNA為模板分別克隆出 65 bp的 hPDGF-BΔ103-118和hPDGF-BΔ152-167編碼序列 (圖 1A)，重組質(zhì)粒pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGFBΔ152-167經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后，消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳可見394 bp酶切片段 (圖1B)；基因測(cè)序結(jié)果正確。

2.2　6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 及 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白的原核表達(dá)和純化

重組質(zhì)粒 pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167以及對(duì)照空質(zhì)粒pET28轉(zhuǎn)化入BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)菌，次日LB半固體平板生長(zhǎng)菌落數(shù)較多，挑取單克隆菌落在卡那霉素抗性 LB液體培養(yǎng)基中大量擴(kuò)增后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，12% SDS-PAGE可見約16.3 kDa的6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和16.4 kDa的6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白表達(dá)條帶；BL21(DE3)-pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118和 BL21(DE3)-pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167 表達(dá)蛋白經(jīng) Ni-NTA純化后可見相同大小的重組蛋白純化條帶 (圖2)。

圖1　目的基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定Fig. 1 Amplification products of target genes and identification of the recombinant plasmids by PCR and restriction enzyme analysis. (A) Amplification products of hPDGF-BΔ103-118 and hPDGF-BΔ152-167 gene with PCR. M: 50 bp Ladder DNA marker; 1,2:PDGF-BΔ103-118 and hPDGF- BΔ152-167 amplified fragments. (B) Identification of the recombinant plasmids pET28-Trx-hPDGF-BΔ103-118 and pET28-Trx-hPDGFBΔ152-167 by PCR and restriction enzyme analysis. M:DNA ladder mix; 1–3: pET28-Trx,pET28-TrxhPDGF-BΔ103-118,pET28-Trx-hPDGF-BΔ152-167.

2.3　ELISA法測(cè)定血清hPDGF-B抗體滴度結(jié)果

分別用6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白和 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫小鼠，這兩種重組蛋白免疫小鼠后抗體滴度很快就達(dá)到1∶8 000，而且組間差異較小 (表2和表3)。

圖2　SDS-PAGE分析純化前后的6×his Trx-hPDGFBΔ103-118及 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白Fig. 2　SDS-PAGE analysis of expressed and purified 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 and 6×his Trx-hPDGFBΔ152-167 proteins. M: unstained protein marker; 1:pET28-E. coli BL21(DE3); 2: pET28-Trx-PDGF103-118-E. coli BL21(DE3); 3: pET28-Trx-PDGF103-118(purified by Ni-NTA); 4: pET28-Trx-PDGF152-167-E. coli BL21(DE3); 5: pET28-Trx-PDGF152-167 (purified by Ni-NTA).

表2　6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118重組蛋白免疫小鼠血清抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 2　pET28-PDGF-B recombinant protein detected antibody titers in 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118 mice antisera

表3　6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白免疫小鼠血清抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 3　pET28-PDGF-B recombinant protein detected antibody titers in 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167 mice antisera

2.4　成功制備并純化hPDGF-B腹水抗體

2.4.1　ELISA法測(cè)定hPDGF-B純化前后腹水抗體滴度結(jié)果。

純化后Anti-hPDGFΔ103-118組和AntihPDGFΔ152-167組腹水抗體滴度均達(dá)到1∶16 000及以上，具有較為理想的抗體滴度 (表4)。

2.4.2　Western blotting驗(yàn)證hPDGF-B純化腹水抗體結(jié)果

Western blotting法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩種hPDGF-B純化腹水抗體 (1∶500) 均能和 pET28-PDGF-B重組蛋白發(fā)生反應(yīng)，在33 kDa處可見PDGF-B重組蛋白條帶。純化后的hPDGF-B腹水抗體可以與膜結(jié)合PDGF-B結(jié)合，可用于下游實(shí)驗(yàn) (圖3)。

2.5　PDGF-BB對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PDGF-BB對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，PDGF-BB各濃度組與對(duì)照組相比，細(xì)胞體外生長(zhǎng)速度明顯加快 (P<0.05)。增殖曲線顯示 PDGF-BB促細(xì)胞增殖的作用與生長(zhǎng)因子濃度呈峰形狀相關(guān)，4 ng/mL濃度時(shí)作用最強(qiáng) (圖4)。

表4　純化前后 Anti-hPDGFΔ103-118組和 AntihPDGFΔ152-167組腹水抗體滴度 (pET28-PDGF-B重組蛋白包板)Table 4　pET28-PDGF-B recombinant protein detected ascite antibody titers of Anti-hPDGFΔ103-118 and Anti-hPDGFΔ152-167 　groups 　before 　and 　after purification

圖3　Western blotting檢測(cè)純化后的hPDGF-B腹水抗體與pET28-PDGF-B重組蛋白的結(jié)合反應(yīng)Fig. 3　Western blotting analysis of purified hPDGF-B ascites antibody responses to pET28-PDGF-B proteins. 1:anti-hPDGFΔ103-118 antibody; 2: anti-hPDGFΔ152-167 antibody; 3: His tag antibody.

圖4　PDGF-BB對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 4　Positive effect of PDGF-BB on HepG2 cells proliferation. Compared with the control group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously accelerated in different PDGF-BB concentration groups (P<0.05).

2.6　hPDGF-B腹水抗體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 ng/mL PDGF-BB組和對(duì)照組相比明顯促HepG2細(xì)胞增殖，同時(shí)兩種PDGF-B純化腹水抗體均能明顯抑制PDGF-BB所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，隨著抗體濃度的增加，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，組間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05) (表5)。

表5　hPDGF-B抗體對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Table 5　Inhibitory effect of Anti-hPDGF-B antibodies on HepG2 cell proliferation

圖5　hPDGF-B抗體對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 5　Inhibitory effect of Anti-hPDGF-B antibodies on HepG2 cell proliferation. Compared with serum-free medium group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously inhibited in Anti-hPDGF-BΔ103-118 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution) and Anti-hPDGF-BΔ152-167 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution; P<0.05).Compared with 4 ng/mL PDGF-BB group,the growth rate of the HepG2 cells was obviously inhibited in PDGF-BB+Anti-hPDGF-BΔ103-118 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution) and PDGF-BB+Anti-hPDGFBΔ152-167 antibody groups (1:10 dilution and 1:40 dilution; P<0.05).

3　討論

肝細(xì)胞癌 (HCC)是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，由于起病隱匿、病情發(fā)展迅速、手術(shù)復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高等特點(diǎn)，中晚期肝癌的治療效果并不理想，故現(xiàn)在迫切需要探索新的有效治療方法。

PDGF作為已有 30余年歷史的肽類生長(zhǎng)因子，最初發(fā)現(xiàn)其為一種重要的促有絲分裂因子，主要作用于成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)PDGF既參與重要的生理活動(dòng)，如胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)等，同時(shí)又與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如肝纖維化、心肌過度纖維化、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤、前列腺癌等[10-11]。PDGF及其受體的過度表達(dá)是腫瘤常見的特征之一，在皮膚癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中均可檢測(cè)到高表達(dá)水平的PDGF及其受體[8]。研究發(fā)現(xiàn)PDGF與其受體結(jié)合后可使受體酪氨酸激酶激活，從而激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，主要通過自分泌的形式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可通過旁分泌的形式促進(jìn)血管和淋巴管的生成，調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的生成和降解[12-14]。目前認(rèn)為PDGF可能主要通過 3個(gè)方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展：腫瘤細(xì)胞自分泌刺激；刺激血管生成；腫瘤微環(huán)境的調(diào)控。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn) PDGF在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程可能發(fā)揮重要作用[15-17]，這提示我們PDGF及其受體可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

肝癌的發(fā)生和發(fā)展與多種細(xì)胞因子有關(guān)，而且涉及多條信號(hào)通路，如何在療效和毒副作用之間選擇最佳的治療方法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)于中晚期肝癌臨床上尚缺乏安全、有效的治療方法，雖然多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑索拉非尼通過對(duì)酪氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制作用明顯延長(zhǎng)了晚期肝癌患者的生存期[4]，但是由于價(jià)格較高，而且在用藥過程中存在較多的毒副作用，限制了其在臨床上的應(yīng)用。鑒于PDGF在腫瘤細(xì)胞自分泌刺激、促進(jìn)血管生成及對(duì)調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用，我們認(rèn)為有必要研究和開發(fā)高效、方便、安全、價(jià)廉的阻斷PDGF的藥物或手段?？紤]到完全阻斷 PDGF/PDGFR信號(hào)通路技術(shù)難度較大，而且可能引起較多的毒副作用，仔細(xì)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)PDGF-B相較于其他幾種亞型結(jié)構(gòu)研究最為清楚，而且在肝癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，我們認(rèn)為選擇性地阻斷 PDGF-B有望達(dá)到理想效果。目前阻斷PDGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法主要有基因沉默、DNA適配子、PDGF可溶性受體及受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑等[18-21]，但是由于技術(shù)難度大，價(jià)格高昂、副作用大等缺點(diǎn)難以在臨床推廣使用。相較于上述幾種阻斷PDGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，細(xì)胞因子疫苗通過基因工程改造過的大腸桿菌表達(dá)，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性PDGF抗體，不會(huì)整合到免疫動(dòng)物基因組，也不會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的過敏反應(yīng)；而且國內(nèi)外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子疫苗不會(huì)造成其他正常器官的損傷，因此PDGF-B疫苗有治療高效、制作方法簡(jiǎn)單、使用方便、作用持久等無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤治療中有良好的臨床應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)通過PDGF-B重組蛋白主動(dòng)免疫的方式，刺激機(jī)體產(chǎn)生hPDGF-B抗體，觀察hPDGF-B抗體對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，旨在探討PDGF-B疫苗構(gòu)建及阻斷PDGF/PDGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在HCC治療中的可行性。實(shí)驗(yàn)中選用硫氧還蛋白融合蛋白表達(dá)體系作為原核表達(dá)載體，其在大腸桿菌中可高產(chǎn)量地表達(dá)可溶性目的蛋白質(zhì)，即通過pET28-Trx空載質(zhì)粒作為載體，向其中分別連入2段來自PDGF-B的關(guān)鍵編碼序列，經(jīng)原核表達(dá)純化出兩種重組蛋白 6×his Trx-hPDGFBΔ103-118和 6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167，通過主動(dòng)免疫小鼠成功制備并純化出2種PDGF-B多克隆抗體，純化后的腹水抗體滴度可達(dá)1∶16 000以上，而且抗體能與膜結(jié)合的PDGF-B反應(yīng)，證實(shí)兩種重組蛋白具有良好的免疫原性；通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 2種 PDGF-B純化腹水抗體(≥1∶40稀釋度) 均可有效抑制PDGF-BB對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 6×his Trx-hPDGF-BΔ103-118及6×his Trx-hPDGF-BΔ152-167重組蛋白具有較高的免疫原性，其作為免疫原均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的PDGF-B中和性抗體，而且PDGF-B純化腹水抗體具有良好的中和活性，可有效抑制PDGF-BB對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，這為利用不同表位組合構(gòu)建PDGF-B疫苗提供了新的方法，也為臨床上HCC的治療提供了一種新的思路。

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