基于包膜蛋白和Tat蛋白篩選HIV-1細(xì)胞融合抑制劑的高效方法

王小利，楊怡姝，沈思嗣，王先良，馮甜，胡秦，曾毅

1 北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京　100124

2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全研究所，北京　100123

艾滋病 (Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS) 是由人免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 引起的一種逐步摧毀人體免疫系統(tǒng)、嚴(yán)重威脅人類健康和生存的重大傳染性疾病。發(fā)現(xiàn)30多年來，至今仍無(wú)法徹底治愈[1-3]。許多研究致力于發(fā)現(xiàn)新型的抗HIV病毒藥物和治療方案[4-6]。

HIV-1在體內(nèi)的復(fù)制可通過病毒顆粒感染靶細(xì)胞或者通過已感染HIV的細(xì)胞感染靶細(xì)胞。后者稱為細(xì)胞介導(dǎo)的病毒傳播途徑，許多研究認(rèn)為該途徑對(duì)HIV體內(nèi)傳播非常重要，其感染效率比病毒粒子感染高出多個(gè)數(shù)量級(jí)[7-10]。因此，阻斷該傳播途徑對(duì)HIV的治療有重大意義。

細(xì)胞與細(xì)胞融合系統(tǒng)是篩選細(xì)胞介導(dǎo)的HIV傳播阻斷劑的有效手段。目前具有融合阻斷作用的上市藥物為T-20和Maraviroc (Mar)，這些藥物已經(jīng)存在耐藥性等問題[11-13]。許多研究建立了不同效應(yīng)細(xì)胞-靶細(xì)胞的融合系統(tǒng)，采用不同的HIV Env質(zhì)粒和不同的檢測(cè)指標(biāo)[14-18]，有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)了一些具有融合抑制作用的化合物[14,17,19]，但沒有深入研究的報(bào)道。曾祥鳳等[20]建立的將H9慢性感染細(xì)胞和 MT2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合的篩選方法，需要加入鈣熒光素，其可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響，而且融合和非融合細(xì)胞均有綠色熒光，靠人為區(qū)分，主觀因素大，背景值高，終點(diǎn)檢測(cè)用p24試劑盒，價(jià)格昂貴，成本高。李珉珉等建立了基于細(xì)胞-細(xì)胞融合的 HIV進(jìn)入抑制劑非感染性篩選方法，將兩種細(xì)胞融合后，直接觀察合胞體的形成[21]，該方法靈敏性不高，主觀因素大。

HIV的包膜蛋白gp120和gp41，非共價(jià)結(jié)合成三聚體，在病毒表面或感染的細(xì)胞表面形成突起。在輔助受體CCR5或CXCR4等協(xié)助下，gp120蛋白識(shí)別靶細(xì)胞的 CD4分子并與其結(jié)合，gp120與 gp41分離，gp41構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出融合功能區(qū)并插入到靶細(xì)胞膜中，導(dǎo)致病毒包膜或感染的細(xì)胞膜同靶細(xì)胞膜的融合[22-24]。HIV的 Tat蛋白在細(xì)胞蛋白復(fù)合物的參與下，與HIV 的長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (LTR) 中的TAR RNA相互作用，調(diào)節(jié) HIV基因的表達(dá)。TZM-bl細(xì)胞株來自子宮頸癌細(xì)胞HeLa，高表達(dá)CXCR4分子，穩(wěn)定表達(dá)CD4分子和CCR5分子。該細(xì)胞導(dǎo)入了熒光素酶報(bào)告基因和大腸桿菌β-gal報(bào)告基因，由LTR控制。Tat蛋白與LTR結(jié)合可誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)。

本研究建立了一種高效篩選HIV細(xì)胞融合抑制劑的檢測(cè)方法 (圖1)。首先構(gòu)建了表達(dá)GFP蛋白和Tat蛋白的表達(dá)載體，該質(zhì)粒與HIV的Env質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK-293T細(xì)胞，獲得高表達(dá) HIV-1包膜蛋白和Tat蛋白的效應(yīng)細(xì)胞。TZM-bl細(xì)胞作為靶細(xì)胞。當(dāng)兩種細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞表面的包膜蛋白識(shí)別結(jié)合靶細(xì)胞的CD4、CCR5和/或CXCR4受體，兩種細(xì)胞發(fā)生融合，Tat蛋白擴(kuò)散到靶細(xì)胞，激活報(bào)告基因，產(chǎn)生兩種報(bào)告蛋白β-半乳糖苷酶和熒光素酶。通過藍(lán)斑計(jì)數(shù)或熒光素酶檢測(cè)反映融合情況。當(dāng)兩種細(xì)胞融合時(shí)，加入待測(cè)樣本，如果報(bào)告基因表達(dá)減弱或缺失，則說明該樣本具有阻斷細(xì)胞融合的作用。用已明確作用靶點(diǎn)的HIV上市藥物評(píng)價(jià)了該篩選系統(tǒng)，證明該方法可有效測(cè)定藥物是否具有細(xì)胞融合抑制特性。

圖1　HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)原理Fig. 1　Assay scheme for HIV-1 Env-mediated cell-cell fusion. The effector cells (HEK-293T) that express Env and Tat protein,were co-cultured with target cells(TZM-bl). The Cell-cell fusion enables the diffusion of Tat protein to target cells and thus activated the transcription of the Tat-inducible reporter gene. The efficiency of fusion was quantitated by reporter protein measurement.

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　細(xì)胞、質(zhì)粒

HEK-293T細(xì)胞、TZM-bl細(xì)胞由中國(guó)疾病控制中心病毒病研究所惠贈(zèng)。質(zhì)粒 HIV-NL4.3和HIV-1 B亞型包膜質(zhì)粒pREJO4541.67 Env (編號(hào)為11035，本文以11035-Env表示) 由NIH AIDS Reagent Repository獲得。質(zhì)粒HIV-NL4.3攜HIV-1 B亞型毒株全長(zhǎng)基因組，用以獲取tat基因序列，質(zhì)粒pREJO4541.67 Env表達(dá)HIV-1包膜蛋白Env基因序列。

1.1.2　載體和試劑

pGEM-T載體和pEGFP-C3載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑FUGENE 6、Bright-glo熒光素酶檢測(cè)試劑盒等購(gòu)自Promega公司；BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。引物合成及基因測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。亞鐵氰化鉀、鐵氰化鉀等化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

1.1.3　測(cè)定藥物

Mar、AZT、Raltegravir (Ral) 購(gòu)自 MCE 公司。Myr購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；HZ、BS、QQ 購(gòu)自北京同仁堂藥店；HPB、KH 為本實(shí)驗(yàn)室合成；ZL-1為進(jìn)行臨床Ⅱ期測(cè)試的藥物。

1.2　方法

1.2.1　pEGFP-Tat真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

引物設(shè)計(jì)：以HIV-1 NL4.3的tat基因序列為模板，設(shè)計(jì)、合成引物，擴(kuò)增含有兩個(gè)外顯子的tat基因序列。上游引物為：5′-CTCGAGAGCCAC CATGGAGCCAGTAGATCCT-3′，引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物為：5′-GGATCCAATTCCTTCGGG CCTGT-3′，引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

pEGFP-Tat質(zhì)粒的構(gòu)建：從轉(zhuǎn)染了HIV-1 NL4.3質(zhì)粒的HEK-293T細(xì)胞中提取總RNA，以該RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增tat基因，純化回收PCR產(chǎn)物，連接到pGEMT載體，構(gòu)建pGEMT-Tat質(zhì)粒。將pGEMT-Tat質(zhì)粒進(jìn)行XhoⅠ、BamH Ⅰ雙酶切，回收純化tat酶切片段。tat的回收產(chǎn)物和pEGFP-C3載體連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增提取，得到pEGFP-Tat質(zhì)粒，該質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測(cè)序鑒定。

1.2.2　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK-293T細(xì)胞接種六孔板。第2天將pEGFP-Tat質(zhì)粒和11035-Env包膜質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，制備效應(yīng)細(xì)胞。第3天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的靶細(xì)胞TZM-bl接種到96孔板。第4天，收集轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的 HEK-293T效應(yīng)細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，加入接種有TZM-bl細(xì)胞的96孔板中，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡攝像 (Observer A1，Zeiss，德國(guó))。報(bào)告蛋白 β-半乳糖苷酶用藍(lán)斑染色試劑檢測(cè)[25]，用1%甲醛，0.2%戊二醛固定液固定樣本，用 2 μmol/L 亞鐵氰化鉀、0.2 μmol/L 鐵氰化鉀、2 μmol/L氯化鎂、40 μg/mL X-gal染色液染色，熒光顯微鏡 (IX71，Olympus，日本) ImagPro軟件進(jìn)行藍(lán)斑計(jì)數(shù)。熒光素酶檢測(cè)按照 Bright-glo熒光素酶試劑盒步驟操作，多功能酶標(biāo) (Enspire，PE，美國(guó)) 測(cè)定熒光素酶值。

1.2.3　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)條件優(yōu)化

優(yōu)化HEK-293T效應(yīng)細(xì)胞的制備條件：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK-293T細(xì)胞按照3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種六孔板。第2天，將pEGFP-Tat質(zhì)粒和11035-Env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。根據(jù)tat:env質(zhì)粒不同的量設(shè)不同實(shí)驗(yàn)組，24 h、48 h、72 h熒光顯微攝像及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染情況，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 TZM-bl靶細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，每孔10 000個(gè)細(xì)胞，貼壁0、2、6、24 h時(shí)加入效應(yīng)細(xì)胞，共孵育24 h，熒光顯微鏡攝像及報(bào)告基因檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞融合情況，確定靶細(xì)胞最佳貼壁時(shí)間。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TZM-bl細(xì)胞按照10 000個(gè)/孔接種96孔板，貼壁24 h。將HEK-293T效應(yīng)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按照效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞數(shù)目比例為 0.5∶1、1∶1、2∶1、4∶1的比例加入96孔板中，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡攝像及報(bào)告蛋白檢測(cè)測(cè)定細(xì)胞融合情況，確定兩種細(xì)胞最佳比例。

1.2.4　細(xì)胞融合系統(tǒng)篩選融合抑制劑的特異性

將HIV-1上市藥物Mar、AZT 和Ral 10倍比稀釋成一系列的濃度梯度，與效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)加入靶細(xì)胞中孵育。同時(shí)設(shè)立融合陽(yáng)性對(duì)照組 (FC，只有效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞孵育) 和空白對(duì)照組(Mock，只轉(zhuǎn)染了 pEGFP-Tat質(zhì)粒的 HEK-293T細(xì)胞和靶細(xì)胞孵育)。24 h后，用藍(lán)斑染色法和熒光素酶法分別測(cè)定細(xì)胞融合情況。

1.2.5　細(xì)胞融合系統(tǒng)篩選具有融合抑制作用的樣本

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TZM-bl細(xì)胞接種96孔板，第2天加入不同濃度梯度的待測(cè)樣本，培養(yǎng)24 h，CCK8檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。細(xì)胞死亡率在10%以下認(rèn)為無(wú)細(xì)胞毒性。將待測(cè)樣本無(wú)細(xì)胞毒劑量作為最高濃度稀釋為系列濃度梯度，與效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)加入靶細(xì)胞共孵育24 h，Mar作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，AZT為陰性對(duì)照藥物。檢測(cè)報(bào)告基因，計(jì)算融合抑制率。

融合抑制率 (%) = (FC組藍(lán)斑數(shù)–加藥組藍(lán)斑數(shù)) / (FC組藍(lán)斑數(shù)–Mock組藍(lán)斑數(shù)) ×100。

1.2.6　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為 3次或以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用GraphPad PRISM6.0繪圖及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1　真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Tat的構(gòu)建

HIV-1 NL4.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增tat片段，電泳圖見圖2A。在250 bp附近有明顯的擴(kuò)增條帶，tat片段為261 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。構(gòu)建真核表達(dá)克隆 pEGFP-Tat，酶切鑒定，所得片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符 (圖2B)。將pEGFP-Tat酶切結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆送上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)后完全正確。

2.2　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)

圖2　tat基因PCR產(chǎn)物與各重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig. 2　Agarose gel electrophoresis of PCR amplified tat gene and the restrictive endonuclease analysis of constructed plasmids. (A) PCR amplification of tat gene. (B) pEGFP-Tat digested with BamHⅠand XhoⅠ.

將11035-Env和pEGFP-Tat兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，Env質(zhì)粒表達(dá)包膜蛋白，pEGFP-Tat質(zhì)粒表達(dá)Tat蛋白和GFP熒光蛋白，GFP的亮度和表達(dá)率反映了蛋白表達(dá)量的多少，表達(dá)率越高，轉(zhuǎn)染效率越高。將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒的HEK-293T效應(yīng)細(xì)胞與TZM-bl細(xì)胞共培養(yǎng)以后，兩種細(xì)胞兩兩融合或多個(gè)相互融合，形成大的合胞體或多核細(xì)胞，顯微鏡明場(chǎng)觀察 (圖3C)，多為巨型細(xì)胞，細(xì)胞邊緣不整齊，模糊不清，顆粒增多，形態(tài)多樣，呈疊層生長(zhǎng)，熒光觀察，有些細(xì)胞中呈現(xiàn)多個(gè)綠色熒光體，藍(lán)斑染色發(fā)現(xiàn)有的細(xì)胞含有一個(gè)藍(lán)斑，有的含有多個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)。只轉(zhuǎn)染了Tat蛋白的HEK-293T細(xì)胞與TZM-bl細(xì)胞共孵育后 (圖3B)，顯微鏡明場(chǎng)下沒有巨型細(xì)胞，只有單個(gè)的細(xì)胞，熒光觀察，只能看到單個(gè)熒光的HEK-293T細(xì)胞，細(xì)胞藍(lán)斑染色未見藍(lán)色斑點(diǎn)。

2.3　細(xì)胞-細(xì)胞融合條件的優(yōu)化

2.3.1　pEGFP-Tat質(zhì)粒與11035-Env包膜質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的影響

不同量的Tat質(zhì)粒和Env質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。從圖4A、4B可知，當(dāng)Tat質(zhì)粒1 μg、Env質(zhì)粒0.5 μg時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率最高。共轉(zhuǎn)染24、48、72 h顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)48 h比24 h強(qiáng)，與72 h無(wú)顯著差異 (結(jié)果未顯示)，因此選取轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行融合實(shí)驗(yàn)。

圖3　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)顯微鏡攝像分析 (200×)Fig. 3　Direct visualization of cell-cell fusion system (200×). The effector cells (HEK-293T) were developed by co-transfection of pEGFP-Tat and p11035-Env plasmids. (A) The optical imaging of effector cells and target cells(TZM-bl) without fusion. Two cell types were co-cultured for 24 h and analysed for Tat expression as well as blue plaques under fluorescence microscope. (B) HEK-293T cells that transfected with only pEGFP-Tat were used as mock group. (C) HEK-293T and TZM-bl fusion group.

2.3.2　TZM-bl細(xì)胞貼壁時(shí)間對(duì)融合效率的影響

在TZM-bl細(xì)胞貼壁0、2、6、24 h時(shí)加入效應(yīng)細(xì)胞，共孵育 24 h后，進(jìn)行藍(lán)斑染色，發(fā)現(xiàn)隨著貼壁時(shí)間延長(zhǎng)，藍(lán)斑數(shù)增多，24 h為最高(圖4C)。結(jié)果提示靶細(xì)胞貼壁時(shí)間對(duì)兩種細(xì)胞的融合效果有顯著影響，本系統(tǒng)選取貼壁24 h后進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3.3　效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)量對(duì)細(xì)胞融合的影響

TZM-bl細(xì)胞10 000個(gè)/孔接種96孔板，24 h后加入不同量的HEK-293T效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，24 h后藍(lán)斑計(jì)數(shù) (圖 4D)。隨著效應(yīng)細(xì)胞的增多，融合的藍(lán)斑細(xì)胞數(shù)增多，當(dāng)每孔加到20 000個(gè)效應(yīng)細(xì)胞，即HEK-293T與TZM-bl細(xì)胞為2∶1時(shí)，藍(lán)斑數(shù)最多，融合效率最高，隨著效應(yīng)細(xì)胞的增加，當(dāng)二者比例為4∶1時(shí)，融合效率下降，藍(lán)斑數(shù)降低，因此選取效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的數(shù)目分別為20 000和10 000作為最佳融合條件。

2.4　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)藥物篩選的特異性

將已知不同靶點(diǎn)的上市藥物 Mar、AZT和Ral作用于該細(xì)胞融合系統(tǒng)。Mar為CCR5抑制劑，具有抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合的作用，AZT為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，Ral為整合酶抑制劑，二者均沒有融合抑制功能。由圖5可知，無(wú)論是藍(lán)斑計(jì)數(shù)法還是熒光素酶法，Mar高劑量組測(cè)定值與融合對(duì)照組 (FC) 相比，有顯著性差異 (P<0.05)，說明其具有抑制融合的作用，而且結(jié)果還顯示Mar與融合存在劑量效應(yīng)關(guān)系。AZT和Ral組與FC組相比，無(wú)顯著性差異 (P>0.05)，沒有融合抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各藥物抗病毒作用的靶點(diǎn)相符合，表明該方法篩選細(xì)胞融合抑制劑有良好的特異性。

圖4　細(xì)胞-細(xì)胞融合條件優(yōu)化Fig. 4　Optimization of cell-cell fusion system. (A) Titration of the ratio of pEGFP-Tat: 11035-Env on transfection efficiency by fluorescence microscopy (100×). (B) Titration of the ratio of pEGFP-Tat: 11035-Env on transfection efficiency by flow cytometry. (C) The optimal seeding time of TZM-bl cells prior to co-culture with HEK-293T cells.(D) The ratios of 293T: TZM-bl cells on the fusion efficiency. All data were expressed as ±s(n≥3).

2.5　藥物的篩選

用該系統(tǒng)測(cè)試了6種天然藥物 (包括提取物)及兩種合成的化合物，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)這些樣本在細(xì)胞水平具有一定的HIV-1抑制作用。細(xì)胞融合系統(tǒng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，有兩種藥物Myr和KH對(duì)融合有一定的抑制作用，高劑量組抑制率達(dá)到50%以上，半數(shù)抑制濃度為 7.483 μg/mL和5.646 μg/mL，提示這兩種藥物可能通過抑制融合作用發(fā)揮抗病毒作用，其他幾種藥物的抗病毒作用與細(xì)胞融合無(wú)關(guān) (圖6A和6B)。

3　討論

圖5　細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)可行性及特異性檢測(cè)Fig. 5　The validation of the cell-cell fusion system. (A) The system was validated with 3 FDA-approved anti-HIV-1 drugs,including CCR5 antagonist maraviroc (positive control),reverse transcription inhibitor zidovudine (AZT) and integrase inhibitor raltegravir (negative controls). The fusion efficiency was detected using blue plaque assay (A) and luciferase assay (B). All data were expressed as ± s (n≥3); ** P<0.05 (Student’s t tests). FC: fusion control,refers to 293T-Tat-Env and TZM-bl co-culture group; Mock refers to 293T-Tat and TZM-bl co-culture group.

本研究利用Env蛋白介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞融合，Tat蛋白反式激活因子與LTR相互作用，調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，建立了一個(gè)高效的細(xì)胞融合系統(tǒng)。我們構(gòu)建了EGFP-Tat蛋白表達(dá)質(zhì)粒，EGFP作為指示蛋白，評(píng)價(jià)效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生的效率。當(dāng)兩種細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞表面的gp120、gp41識(shí)別靶細(xì)胞的CD4、CCR5和/或CXCR4受體，發(fā)生細(xì)胞融合，Tat蛋白擴(kuò)散到靶細(xì)胞，激活報(bào)告基因。影響上述過程中任一或多個(gè)蛋白活性，或者影響蛋白之間相互作用過程，都會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因的變化。因此該方法篩選的有抑制作用的樣品，可能作用于某個(gè)融合靶點(diǎn)，也可能作用多個(gè)靶點(diǎn)，可廣泛篩選具有切斷細(xì)胞-細(xì)胞傳播作用的藥物。用Mar作為陽(yáng)性藥，AZT和 Ral為陰性藥，評(píng)價(jià)細(xì)胞融合系統(tǒng)篩選抑制劑的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該系統(tǒng)可有效篩選融合抑制劑，特異性強(qiáng)，背景值低。藍(lán)斑染色法和熒光素酶兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。

利用HEK-293T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，該細(xì)胞株可以高效表達(dá)外源蛋白，表達(dá)率可達(dá)60%以上，保證了效應(yīng)細(xì)胞的高效性。EGFP作為指示蛋白，通過熒光顯微鏡，可以實(shí)時(shí)快速反映轉(zhuǎn)染蛋白表達(dá)情況和細(xì)胞融合情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)還可以確定表達(dá)了Tat、Env蛋白效應(yīng)細(xì)胞的比例，不同于De-Chun Cheng等[14,21]建立的系統(tǒng)，只有進(jìn)行到細(xì)胞融合的終點(diǎn)才能評(píng)價(jià)此次實(shí)驗(yàn)融合情況。

Tat調(diào)控蛋白只有通過融合作用才能進(jìn)入靶細(xì)胞調(diào)控報(bào)告基因的表達(dá)，非特異性低。該方法有熒光素酶和 β-半乳糖苷酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)，均可反映樣本對(duì)融合的抑制情況。用熒光素酶試劑盒測(cè)定，靈敏度高，時(shí)間短，出結(jié)果快；基于 β-半乳糖苷酶特性進(jìn)行的細(xì)胞藍(lán)斑染色，背景值低，特異性強(qiáng)，檢測(cè)成本低。兩種指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，可排除樣本對(duì)某種報(bào)告蛋白直接影響帶來的假陽(yáng)性，提高檢測(cè)的特異性。但對(duì)報(bào)告蛋白直接影響的樣本很少，因此通常只采取一種檢測(cè)方法即可。用不同的HIV包膜蛋白質(zhì)粒與Tat質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可以建立不同HIV包膜的細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)，篩選針對(duì)某一HIV亞型的細(xì)胞融合抑制劑，優(yōu)于用表達(dá)Env、Tat的細(xì)胞系作為效應(yīng)細(xì)胞的篩選方法[26-27]。但同時(shí)這也成為該方法不足之處，效應(yīng)細(xì)胞蛋白瞬時(shí)表達(dá)，增加篩選的時(shí)間和系統(tǒng)的變異性。但由于 HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染率差異在3%以內(nèi)，對(duì)融合效果檢測(cè)影響不顯著。

圖6　融合系統(tǒng)測(cè)定樣本Fig. 6　The screening for fusion inhibitor using cell-cell fusion system. (A) Ten anti-HIV-1 agents were tested in the cell-cell fusion system. Mar: 0.2 μmol/L; AZT: 0.2 μg/mL; Myr: 10 μg/mL; KH: 20 μg/mL; HZ: 150 μg/mL; BS:150 μg/mL; QQ: 100 μg/mL; ZL-1: 100 μg/mL; LQ: 150 μg/mL. (B) The dose-effect curves of Mar,AZT,Myr and KH on HIV-1 cell-cell fusion. All data were expressed as ±s(n≥3).

用該系統(tǒng)篩選了8個(gè)樣本，Mar為融合陽(yáng)性藥物對(duì)照，AZT為融合陰性藥物對(duì)照。首先用CCk8方法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒性，用藥物的無(wú)毒劑量進(jìn)行融合篩選實(shí)驗(yàn)，排除藥物的細(xì)胞毒性對(duì)融合的影響，發(fā)現(xiàn)天然化合物Myr和化學(xué)合成物質(zhì)KH具有顯著抑制融合作用，最高劑量的抑制率在50%以上，IC50分別為 7.483 μg/mL 和 5.646 μg/mL，為篩選具有融合作用的藥物提供了有效的方法。

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