克老素抑制地塞米松誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡

黃　倩，李寶善，梁　霄，劉　丹，馬厚勛

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病科,重慶　400016；2. 重慶市急救醫(yī)療中心老年病科，重慶　400014)

地塞米松(dexamethasone, DEX)等糖皮質(zhì)激素作為臨床上極為常用的抗炎藥、免疫抑制藥，廣泛用于諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、慢性阻塞性肺疾病等疾病的治療。大劑量或者長期低劑量的使用糖皮質(zhì)激素可能導(dǎo)致多種骨相關(guān)性不良反應(yīng)，包括骨質(zhì)疏松和骨壞死，該效應(yīng)具有劑量與時(shí)間依賴性。盡管糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為臨床上最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，然而就其治療干預(yù)性研究仍需做深入探討[1-2]。已有研究表明，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松及其并發(fā)骨折的原因在于糖皮質(zhì)激素使成骨細(xì)胞數(shù)量減少，其具體機(jī)制是抑制成骨細(xì)胞形成，促使其凋亡[3]。

克老素(Klotho, KL)基因及其表達(dá)與人類包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的數(shù)種衰老表型關(guān)系極為緊密[5]。本課題組前期就攜帶KL基因的腺相關(guān)病毒感染骨質(zhì)疏松模型大鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)大鼠骨質(zhì)疏松病情及其骨微結(jié)構(gòu)的破壞可通過上調(diào)KL表達(dá)得以緩解[4]；同時(shí)，通過上調(diào)大鼠原代成骨細(xì)胞的KL基因表達(dá)水平的體外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)KL可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性[6]。而有關(guān)人類KL基因研究結(jié)果還證實(shí)，在老年人群中，血漿KL濃度較低人群更易致骨量丟失，這與骨礦物質(zhì)密度降低致使骨折風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[7]。盡管已有研究證實(shí)KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)在原發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了極其重要作用，但有關(guān)KL基因表達(dá)在以糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松為代表的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展中的分子生物學(xué)機(jī)制研究報(bào)道甚少。為此，本研究通過轉(zhuǎn)染攜帶KL基因的重組腺病毒(recombination adenovirus containing KL gene, Ad-KL)于MC3T3-E1成骨細(xì)胞，并構(gòu)建DEX誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松的細(xì)胞模型，探究KL表達(dá)上調(diào)對MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡的影響，為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松的預(yù)防及治療提供新的依據(jù)及基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1細(xì)胞與試劑MC3T3-E1細(xì)胞購自上海和元生物。DEX(5 g·L-1)購自重慶太極集團(tuán)西南藥業(yè)，相對分子質(zhì)量516.41，批次：170109；帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因的重組腺病毒(recombination adenovirus containing GFP gene, Ad-GFP)及Ad-KL購自上海吉?jiǎng)P公司；qPCR相關(guān)試劑均購自大連TaKaRa公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)分析試劑盒買于日本同仁研究所；ɑ-MEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自德國PAN公司；青霉素-鏈霉素(雙抗)溶液、0.25%胰酶、配膠試劑盒等購自碧云天公司；兔抗鼠KL多克隆抗體購自英國Abcam；兔抗鼠Bcl-2抗體購自美國CST；兔抗鼠caspase-9抗體購自博奧森生物；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、兔抗鼠Bax抗體購自武漢三鷹生物；兔抗鼠GAPDH購于杭州賢至生物；山羊抗兔IgG熒光二抗購自美國Abbkine公司。

1.1.2儀器CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，低溫高速離心機(jī)(美國Sigma公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀FACSVantage (美國BD公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、DEX濃度篩選與分組

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染MC3T3-E1成骨細(xì)胞于37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)于α-MEM完全培養(yǎng)基中。按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。待細(xì)胞緊密貼壁后，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)=60、80、100、120分別加入Ad-KL和Ad-GFP，各組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。24 h后，常規(guī)培養(yǎng)基替代含病毒液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48 h的形態(tài)學(xué)特征。200倍物鏡下各孔隨機(jī)取3個(gè)視野，分別于綠光及白光下數(shù)同一視野下表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，取均值。轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。按照以上方法篩選出轉(zhuǎn)染最適的MOI值。

1.2.2誘導(dǎo)MC3T3-E1凋亡的DEX濃度篩選將MC3T3-E1成骨細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL培養(yǎng)基。次日，更換至含所需濃度DEX的培養(yǎng)基，分別將濃度為0.125、0.25、0.5、1、2、4 mmol·L-1的DEX加入孔內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8液10 μL，于原培養(yǎng)環(huán)境下孵育1～1.5 h后分析吸光度。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組依據(jù)研究需要，設(shè)立5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對照組(Control組)、DEX誘導(dǎo)組(DEX組)、Ad-KL轉(zhuǎn)染組(KL組)、Ad-KL轉(zhuǎn)染DEX誘導(dǎo)組(KL+DEX組)、Ad-GFP轉(zhuǎn)染DEX誘導(dǎo)組(GFP+DEX組)。本研究以每瓶5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，按如下順序開展實(shí)驗(yàn)：(1)根據(jù)MOI =100的濃度，分別計(jì)算出每孔需加入的Ad-KL和Ad-GFP病毒液的量。各組細(xì)胞換液后，按每瓶1 mL加入培養(yǎng)基，KL組、KL+DEX組添加計(jì)算劑量的Ad-KL病毒液，GFP+DEX組添加Ad-GFP病毒液轉(zhuǎn)染24 h；(2)按每瓶2 mL的劑量更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；(3)更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，此時(shí)，使用含優(yōu)化濃度DEX的培養(yǎng)基培養(yǎng)DEX組、KL+DEX組、GFP+DEX組成骨細(xì)胞。

1.3CCK-8法檢測細(xì)胞存活率依據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，將Control組、DEX組、KL組、KL+DEX組、GFP+DEX組的細(xì)胞分別培養(yǎng)于96孔板，按照設(shè)計(jì)方案的相應(yīng)處理方法處理細(xì)胞，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定其相對存活率。細(xì)胞相對存活率計(jì)算參見文獻(xiàn)[8]。

1.4qPCR檢測各組細(xì)胞KL、Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)依據(jù)前述處理方法建立各組，開展以下實(shí)驗(yàn)。參考試劑盒的詳細(xì)說明，根據(jù)研究需要提取處理組MC3T3-E1成骨細(xì)胞的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增樣本為10 μL體系。擴(kuò)增條件均為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，50個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s，95℃ 50 s終止。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算KL、Bcl-2和Bax mRNA的相對表達(dá)量。小鼠KL上游引物為5′-GTTGGGTCACTGGGTCAATC-3′，下游引物為5′- TCATCGTACAGATGCCAAGC-3′；小鼠Bcl-2上游引物為5′-CCACCTGTGGTCCATCTGAC-3′，下游引物為5′-GGTGCAGCTGACTGGACATC-3′；Bax上游引物為5′-CTGAGCTGACCTTGGAGCAG-3′，下游引物為5′-CCACGTCAGCAATCATCCTC-3′；內(nèi)參基因GAPDH上游引物為5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

1.5Westernblot檢測細(xì)胞中KL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)各研究組細(xì)胞按前述方式培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品加樣，SDS-PAGE電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，250 mA電流轉(zhuǎn)膜30 min，5%脫脂奶封閉2 h，4℃孵育一抗過夜，復(fù)溫、漂洗一抗，然后37℃下孵育二抗，ECL發(fā)光試劑顯影，分析各組KL、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。

1.6免疫熒光分析caspase-9熒光蛋白的表達(dá)以每孔5×103個(gè)的密度將成骨細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，按照每孔100 μL的量加入培養(yǎng)基，各研究組細(xì)胞均采取前述干預(yù)方式。免疫熒光檢測具體操作方法如下：PBS洗3次，多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，按每孔100 μL加入Triton破膜10 min，接著PBS洗4次(輕拍孔板)，甩干孔板，加入適量山羊血清(孔底鋪滿即可)于37℃封閉1 h；吸去封閉液并甩干孔板，按每孔40 μL加入兔抗鼠caspase-9抗體(1 ∶100稀釋)，4℃過夜；37℃復(fù)溫30 min，PBS洗4次；以下步驟均要求暗室內(nèi)操作，稀釋山羊抗兔熒光二抗(1 ∶200)、DAPI(1 ∶100)，按每孔50 μL加入二抗，37℃孵育1 h；吸凈液體，PBS洗4次，滴加DAPI 50 μL作用10 min；PBS洗4次，甩干孔板，加入抗淬滅劑，鋪滿孔底即可。在熒光倒置顯微鏡下觀察研究組細(xì)胞熒光強(qiáng)弱及熒光顯示部位，依據(jù)檢測熒光強(qiáng)度反映其caspase-9熒光蛋白的表達(dá)水平。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率各研究組細(xì)胞按前述分組操作結(jié)束后，均進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)操作:(1)收集瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗1次；(2)消化收集細(xì)胞，以1 500 r·min-1離心5 min；(3)預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清。根據(jù)Annexin V-PE/ 7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒的指示做相應(yīng)處理后，上機(jī)檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2　結(jié)果

2.1DEX對MC3T3-E1成骨細(xì)胞存活率的影響不同DEX濃度處理細(xì)胞后，其存活率隨著DEX濃度的遞增而呈現(xiàn)出遞減的趨勢。當(dāng)DEX濃度為0.5 mmol· L-1時(shí)，存活細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P<0.01)。當(dāng)DEX濃度增至2 mmol·L-1時(shí)，導(dǎo)致40%～60%細(xì)胞死亡，故本實(shí)驗(yàn)選取該濃度值做后續(xù)研究的DEX濃度標(biāo)準(zhǔn)(Fig 1)。

Fig 1　Effect of different concentrations of DEX on MC3T3-E1 cell viability

**P<0.01vsDEX 0 mmol·L-1

2.2重組腺病毒感染細(xì)胞情況及細(xì)胞形態(tài)特征病毒感染細(xì)胞24 h后可見少量熒光表達(dá)，48 h后，熒光強(qiáng)度隨MOI值增加而增強(qiáng)；在MOI=100時(shí)，Ad-GFP和Ad-KL轉(zhuǎn)染效率分別為92.9%、94.7%,且細(xì)胞狀態(tài)良好(Fig 2)。

Fig 2　Transfection efficiency of Ad-GFP and Ad-KL in MC3T3-E1 cells and cell morphology(× 200)

2.3各組細(xì)胞KLmRNA和蛋白表達(dá)情況qPCR和Western blot法分別檢測各研究組細(xì)胞KL mRNA和蛋白的表達(dá)情況。Fig 3結(jié)果顯示，KL轉(zhuǎn)染組與KL+DEX組細(xì)胞KL mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)，Control組、DEX組與GFP+DEX組細(xì)胞也有少量KL mRNA表達(dá)；KL組和KL+DEX組細(xì)胞有明顯的KL蛋白表達(dá)(P<0.01)，其余各組細(xì)胞未檢測出KL蛋白表達(dá)。提示重組KL腺病毒成功感染了MC3T3-E1成骨細(xì)胞，并且其攜帶的KL基因在MC3T3-E1成骨細(xì)胞內(nèi)明顯表達(dá)KL蛋白。

2.4各組細(xì)胞的存活率情況各研究組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后分析其存活率，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，KL組成骨細(xì)胞細(xì)胞存活率與Control組細(xì)胞相當(dāng)，DEX組其成骨細(xì)胞存活率較Control組明顯降低(P<0.01)；KL+DEX組存活率較DEX組、GFP+DEX組均明顯升高(P<0.01)，而對比DEX組，GFP+DEX組成骨細(xì)胞存活率差異無顯著性。

2.5各組細(xì)胞凋亡率Fig 5結(jié)果顯示，與Control組對比，DEX組凋亡率明顯升高(P<0.01)，KL組與Control組相當(dāng)；與DEX組、GFP+DEX組對比，KL+DEX組凋亡率均明顯降低(P<0.01)，而相比于DEX組，GFP+DEX組凋亡率差異無顯著性。

2.6各組細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白BaxmRNA、蛋白的表達(dá)情況Fig 6結(jié)果顯示，與Control組相比，KL組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平明顯增加(P<0.01)，Bax mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.01)；DEX處理組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白水平均明顯降低(P<0.01)，Bax mRNA和蛋白水平均明顯增加(P<0.01)。與DEX處理組對比，KL+DEX組成骨細(xì)胞表達(dá)Bcl-2 mRNA和蛋白水平增高(P<0.01)，而Bax mRNA和蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與GFP+DEX組相比，KL+DEX組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)，而Bax mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)。研究還發(fā)現(xiàn)，對比DEX組，GFP+DEX組表達(dá)Bcl-2、Bax mRNA和蛋白無明顯差異。

Fig 3　Expression of KL mRNA(A) and protein(B) detected by qPCR and Western blot

**P<0.01vscontrol

Fig 4　Cell viability in different groups

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

Fig 5　Apoptotic rate of MC3T3-E1 cells in different groups detected by flow cytometry

A: Control; B: DEX; C: KL; D: KL+DEX; E: GFP+DEX; F: Apoptosis rate.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

Fig 6　Expression of Bcl-2 and Bax mRNA(A) and protein(B) detected by qPCR and Western blot

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

2.7各組細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白caspase-9的熒光表達(dá)情況各研究組細(xì)胞采用免疫熒光法處理后，倒置熒光顯微鏡下觀察促凋亡蛋白caspase-9在細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況。Fig 7結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色熒光，提示蛋白表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)。與Control組相比，DEX組成骨細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01)，而KL組成骨細(xì)胞促凋亡蛋白caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度較Control組降低，但差異無顯著性；與DEX組對比，KL+DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著性降低(P<0.01)；相比于GFP+DEX組，KL+DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度也顯著性降低(P<0.01)，而DEX組成骨細(xì)胞caspase-9熒光表達(dá)強(qiáng)度并無差異。

Fig 7　Caspasee-9 protein expression detected using immunofluorescence(×200)

A: Control; B: DEX; C:KL; D:KL+DEX; E:GFP+DEX; F:Fluorescence level of caspase-9 protein.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsDEX;▲▲P<0.01vsKL+DEX

3　討論

近年來，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松作為使用糖皮質(zhì)激素所帶來的最嚴(yán)重的副反應(yīng)之一，已引起臨床研究者的高度重視。研究表明，致使糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制主要包括：① 通過增強(qiáng)caspase家族成員的促凋亡活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡，致使骨強(qiáng)度和骨質(zhì)量減低[3]；② 通過影響Wnt信號(hào)通路[9]、減少骨形成蛋白的表達(dá)[10]等途徑，抑制成骨細(xì)胞分化并促進(jìn)其凋亡，從而降低骨質(zhì)量；③ 通過減少破骨細(xì)胞自身凋亡，最終致使骨質(zhì)量減少[11]。研究表明糖皮質(zhì)激素對破骨細(xì)胞的影響，其機(jī)制可能與其延長破骨細(xì)胞壽命的同時(shí)還降低了其細(xì)胞活性，進(jìn)而影響骨的重吸收過程有關(guān)。除此之外，糖皮質(zhì)激素還參與鈣在小腸和腎小管內(nèi)的重吸收過程的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對骨代謝過程形成干擾[3]。

KL基因作為衰老抑制基因，自1997年Kuro-o等研究發(fā)現(xiàn)以來，已得到廣泛關(guān)注并進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)KL基因其主要表達(dá)在腎臟、血液、腦脊液等組織器官內(nèi)，其通過跨膜蛋白和分泌蛋白兩種形式發(fā)揮其生物學(xué)作用[5]。KL除其抗衰老外，還抑制氧化應(yīng)激、Wnt信號(hào)通路和insulin/IGF-1信號(hào)通路，促使FoxO轉(zhuǎn)錄因子激活，誘導(dǎo)血管生成，以及通過調(diào)節(jié)骨礦物質(zhì)來干擾鈣磷代謝過程[12]，提示KL與骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。

研究表明，長期使用糖皮質(zhì)激素是醫(yī)源性骨質(zhì)疏松最常見的病因，與其相關(guān)性骨折發(fā)生率也相應(yīng)增加了30%-50%[13]。流行病學(xué)證據(jù)表明，KL基因多態(tài)性與骨鈣素、骨礦物質(zhì)密度、骨質(zhì)疏松等緊密相關(guān)。KL表達(dá)的蛋白主要以分泌型蛋白和跨膜蛋白兩種形式存在，其中分泌型蛋白作為一種激素，主要通過血液、組織液作用于組織器官；而KL表達(dá)的跨膜蛋白被證實(shí)為內(nèi)源性成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor 23, FGF23)發(fā)揮功能的重要媒介，與成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor, FGFR)結(jié)合，共同調(diào)節(jié)FGF23信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮骨代謝調(diào)節(jié)效應(yīng)[14]。鑒于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松已引起臨床醫(yī)療工作者的高度重視，而KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)與骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，因而探討KL基因表達(dá)調(diào)節(jié)在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)性骨質(zhì)疏松中的作用具有十分重要的臨床價(jià)值。

凋亡是細(xì)胞在炎癥和損傷性環(huán)境中，細(xì)胞內(nèi)組件發(fā)生分解的程序性死亡過程?？沟蛲龅鞍譈cl-2通過與促凋亡蛋白Bax結(jié)合,阻斷其分子同源二聚化過程來發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。與之相反，Bax同源二聚化后，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，隨后活化促凋亡蛋白caspase家族成員蛋白酶，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[3]。研究證實(shí)，caspase家族成員中，caspase-3、6、7、8、9參與調(diào)控哺乳動(dòng)物內(nèi)細(xì)胞程序性死亡過程，其中由caspase-8、9啟動(dòng)凋亡程序，caspase-3、6、7執(zhí)行凋亡過程[15]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DEX組相比于Control組成骨細(xì)胞存活率明顯降低，而凋亡率明顯增加；KL+DEX組相比于DEX組存活率明顯增加，而凋亡率明顯降低；此外，相比于GFP+DEX組，KL+DEX組存活率也增加，其細(xì)胞凋亡率也明顯降低；提示KL基因轉(zhuǎn)染發(fā)揮了抗DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，KL+DEX組其成骨細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)較DEX組明顯增加，而促凋亡蛋白Bax的mRNA和蛋白表達(dá)較DEX組明顯降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)KL+DEX組其成骨細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白caspase-9也較DEX組明顯降低，提示KL基因表達(dá)上調(diào)可能增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)或促進(jìn)其生物學(xué)功能，其抗凋亡效應(yīng)可能通過影響B(tài)cl-2與Bax的結(jié)合過程實(shí)現(xiàn)；也可能抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，或者直接通過影響B(tài)ax的同源二聚化過程或下調(diào)Bax的活性，從而減少下游caspase-9等凋亡啟動(dòng)蛋白的活化來發(fā)揮其抗凋亡效應(yīng)。另外，KL也可能直接通過減少促凋亡蛋白caspase-9的表達(dá)，抑制其啟動(dòng)凋亡程序，最終產(chǎn)生抑制細(xì)胞凋亡的作用，然而KL具體通過何種機(jī)制來調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、caspase-9的表達(dá)尚需要進(jìn)一步研究。

綜上，DEX可能通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2、增加促凋亡蛋白Bax和caspase-9的表達(dá)，啟動(dòng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的凋亡程序，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究證實(shí)KL蛋白發(fā)揮了抵抗DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的效應(yīng)，其機(jī)制可能是通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，與抑制促凋亡蛋白Bax、caspase-9表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，這為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的研究、預(yù)防及治療提供了一個(gè)新的參考方向。已有研究證實(shí)，DEX還通過影響Wnt通路而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[9]，而KL參與調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路[12]，推測KL也可能通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路來抑制DEX誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)完成于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，感謝研究中心鄧曉娟老師的悉心指導(dǎo)！)

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