竹節(jié)參總皂苷通過(guò)抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)改善小鼠腫瘤惡病質(zhì)研究

周志勇，陳亞昕，李德鴻，宋亞男，張長(zhǎng)城，袁　丁

(1. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2. 三峽大學(xué)仁和醫(yī)院藥劑科，湖北 宜昌　443000)

惡病質(zhì)是一種復(fù)雜的代謝綜合征，涉及到全身多個(gè)臟器和系統(tǒng)，常繼發(fā)于腫瘤、心力衰竭、急性腎衰竭、慢性阻塞性肺病等疾病。惡病質(zhì)的主要臨床表征為短期內(nèi)體質(zhì)量急劇下降、骨骼肌和脂肪的流失，同時(shí)伴有厭食、乏力、貧血、衰竭等癥狀[1]。統(tǒng)計(jì)顯示，高達(dá)一半的癌癥患者死亡時(shí)伴有惡病質(zhì)發(fā)生，且20%的患者直接死于惡病質(zhì)[2]。惡病質(zhì)不僅會(huì)影響手術(shù)、化療和放療的實(shí)施，同時(shí)會(huì)造成患者嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)不良，降低患者的生活質(zhì)量。研究表明，惡病質(zhì)的發(fā)生機(jī)制與代謝異常、促炎細(xì)胞因子、全身慢性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)肽等諸多因素有關(guān)。其中，免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子增多，引起機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)進(jìn)程，在腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)生機(jī)制中起著十分重要的作用[3]。如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)通過(guò)成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen，MyoD)或caspase途徑抑制骨骼肌的分化，進(jìn)而阻止骨骼肌的再生，而白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)可下調(diào)骨骼肌結(jié)構(gòu)蛋白基因，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)[4]。其次，體外實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α可能通過(guò)下調(diào)脂肪細(xì)胞中脂滴包被蛋白的表達(dá)，使脂肪失去保護(hù)，易在脂肪酶作用下溶解；同時(shí)抑制脂肪細(xì)胞分化，導(dǎo)致脂肪合成減少[5]。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，在下丘腦的食物調(diào)節(jié)中樞中存在IL-1與TNF-α受體，他們能促進(jìn)體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)的表達(dá)，同時(shí)激活一些對(duì)葡萄糖敏感的神經(jīng)元，引起機(jī)體厭食反應(yīng)[6]。

竹節(jié)參(Panacis Japonici Rhizoma)系五加科人參屬植物竹節(jié)參(PanaxjaponicusC. A. Mey.)的干燥呈竹鞭狀根莖，是我國(guó)西南地區(qū)土家族、苗族民間常用中草藥。研究表明，竹節(jié)參具有抗衰老、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性，其主要活性組分為竹節(jié)參總皂苷(saponins fromPanaxjaponicus，SPJ)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，SPJ具有良好的抗炎活性，能有效改善弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎[8]，明顯抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β含量的升高[9]。鑒于此，本課題擬探索SPJ對(duì)腫瘤惡病質(zhì)的治療作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)腫瘤惡病質(zhì)的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/c小鼠，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)三峽大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞株小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院郭澄教授饋贈(zèng)。

1.3藥物與試劑竹節(jié)參購(gòu)自湖北恩施州竹節(jié)參種植基地，經(jīng)三峽大學(xué)藥學(xué)系曾建紅教授鑒定確認(rèn)；蛋白預(yù)染marker、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；流式微球試劑盒、TNF-α及IL-1β抗體購(gòu)自BD公司；NF-κB p65抗體購(gòu)自CST公司；β-actin、肌肉環(huán)指蛋白1(muscle specific RING finger protein，MuRF1)、PAX7抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.4儀器PAC1000電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，ChemiQ4800化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)，CKX41倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，ALLEGRA 64R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。

2　方法

2.1竹節(jié)參總皂苷的提取與制備取竹節(jié)參5 kg，碾碎后以水為提取溶劑提取4次，合并提取液，水浴蒸發(fā)濃縮。所得濃縮液用正丁醇萃取，減壓回收正丁醇，得竹節(jié)參粗浸膏。將粗浸膏溶于水，過(guò) D101大孔樹(shù)脂，上樣前依次用70%乙醇溶液-50%乙醇溶液(1.5 L)-30%乙醇溶液(1.5 L)-水沖洗樹(shù)脂柱，進(jìn)行預(yù)處理。上樣后，用水洗脫至無(wú)色，棄去水洗脫液，以70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液減壓濃縮至浸膏，真空干燥，即得精制竹節(jié)參總皂苷供試品，香草醛-高氯酸紫外分光光度法測(cè)定竹節(jié)參總皂苷含量達(dá)86%。

2.2小鼠結(jié)腸癌腫瘤惡病質(zhì)模型的建立按照文獻(xiàn)報(bào)道方法建立小鼠腫瘤惡病質(zhì)模型[18]，具體方法如下：BALB/c小鼠32只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取24只小鼠前肢側(cè)翼背部皮下注射0.2 mL(約1×106個(gè))CT26細(xì)胞懸液，剩余的8只小鼠作為正常對(duì)照，接種4 d后，捫及小結(jié)節(jié)。每天定時(shí)監(jiān)測(cè)各組小鼠的攝食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)及體質(zhì)量。若荷瘤小鼠較對(duì)照小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少、進(jìn)食量下降、虛弱、精神不振等表現(xiàn)，即進(jìn)入惡病質(zhì)期。

2.3藥物干預(yù)與標(biāo)本采集接種4 d后，將接種小鼠隨機(jī)分為模型組、竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組，每組8只。正常組與模型組灌胃生理鹽水10 mL·kg-1，竹節(jié)參總皂苷低、高劑量組分別灌胃竹節(jié)參總皂苷(20、60 mg·kg-1)，每日給藥1次，連續(xù)給藥27 d。末次給藥24 h后，小鼠眼球采血，分離血清，-80℃凍存，用于檢測(cè)炎性因子。采血后頸椎脫臼處死小鼠，剝離皮下腫瘤稱(chēng)重，取脾臟、脛骨前肌、腓腸肌和附睪脂肪組織并稱(chēng)重，部分腓腸肌組織置于10%福爾馬林溶液中固定，其余組織于-80℃凍存。

2.4觀察指標(biāo)

2.4.1小鼠一般狀態(tài)觀察每日定時(shí)觀察小鼠毛發(fā)、精神狀況以及體質(zhì)量情況。

2.4.2腓腸肌纖維橫切面積的檢測(cè)將經(jīng)福爾馬林溶液固定的腓腸肌組織采用常規(guī)方法包埋成石蠟塊，4 μm厚度連續(xù)橫切片，常規(guī)HE染色后，光鏡觀察，采集圖片。

2.4.3流式微球檢測(cè)血清中TNF-ɑ與IL-1β水平微球法檢測(cè)血清中炎性因子TNF-ɑ和IL-1β的水平，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：CBA分析試劑盒里的每一種捕獲微球表面包被一種特異性抗體，檢測(cè)試劑是PE標(biāo)記的抗體混合物，其熒光強(qiáng)度與微球上捕獲的細(xì)胞因子的量成正比。當(dāng)捕獲微球、檢測(cè)抗體和待測(cè)樣本共同孵育后，三者即形成雙抗夾心復(fù)合物(捕獲微球+分析物+檢測(cè)抗體)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析捕獲微球和微球上結(jié)合抗體的熒光強(qiáng)度，從而得到待測(cè)樣本的數(shù)據(jù)，流式檢測(cè)波長(zhǎng)為488 nm，收集微球數(shù)1×104個(gè)。

2.4.4Western blot檢測(cè)腓腸肌與脛骨前肌中NF-κB p65、PAX7與MuRF1蛋白表達(dá)水平提取各組小鼠腓腸肌總蛋白和核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶，于37℃封閉1.5 h，分別加入β-actin抗體(1 ∶10 000)、NF-κB p65抗體(1 ∶500)、MuRF1抗體(1 ∶1 000)、PAX7抗體(1 ∶500)，4℃孵育過(guò)夜。次日以TBST 洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶10 000)，37℃避光孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

3　結(jié)果

3.1小鼠一般情況及體質(zhì)量變化荷瘤小鼠較正常組小鼠食欲明顯下降，活動(dòng)減少，皮毛顏色暗淡，精神萎靡。竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，低、高劑量組小鼠體質(zhì)量與自發(fā)性活動(dòng)均增加，且高劑量組變化更為明顯。去瘤后體質(zhì)量惡病質(zhì)小鼠較正常組明顯下降，且模型組下降最為明顯(P<0.01)，低、高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組升高(P<0.05)，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1　The body weight of mice after tumor removal(±s, n=8)

3.2腓腸肌、脛骨前肌、附睪脂肪與脾臟質(zhì)量如Tab 1所示，與正常組相比，惡病質(zhì)模型組小鼠腓腸肌和脛骨前肌質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，與模型組相比，高劑量組肌肉重量明顯增加(P<0.05)。模型組小鼠附睪脂肪重量與正常組相比明顯減少(P<0.05)。惡病質(zhì)小鼠脾臟重量均明顯增大(P<0.01)，竹節(jié)參干預(yù)后，脾臟的腫大情況無(wú)明顯改善。

3.3腓腸肌纖維橫切面積如Fig 2所示，與正常組相比，惡病質(zhì)小鼠腓腸肌纖維變細(xì)，肌肉束橫切面積明顯減小，且排列紊亂。竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，明顯增加肌纖維橫截面積，改善惡病質(zhì)導(dǎo)致的肌肉降解，且呈劑量依賴性。

3.4血清中IL-1β與TNF-α含量如Fig 3所示，與正常組相比，腫瘤惡病質(zhì)小鼠血清中IL-1β與TNF-α的含量均明顯上升(P<0.05)，竹節(jié)參總皂苷干預(yù)可明顯改善惡病質(zhì)導(dǎo)致的機(jī)體炎性反應(yīng)。

Fig 2　Effects of SPJ on cross-sectional area of gastrocnemius muscle fiber

A: Control; B: Model; C: 20 mg·kg-1SPJ; D: 60 mg·kg-1SPJ

Fig 3　Effects of SPJ on IL-1β and TNF-α levels in serum of cachexia mice

*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model

3.5腓腸肌與脛骨前肌中NF-κB、PAX7與MuRF1的蛋白表達(dá)如Fig 4所示，與正常組相比，模型組腓腸肌中NF-κB p65與MuRF1的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)，而PAX7在腓腸肌中有所下降。竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，NF-κB與MuRF1的含量下降明顯(P<0.05)，但PAX7表達(dá)變化不明顯。

Tab 1　Weight of gastrocnemius, anterior tibial muscle, epididymal fat and spleen in each group(±s，n=8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Fig 4　Effects of SPJ on protein expression of NF-κB, PAX7 and MuRF1 in gastrocnemius muscle(±s，n=4)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

如Fig 5所示，與正常組相比，模型組脛骨前肌中NF-κB p65含量明顯上升(P<0.05)，MuRF1的表達(dá)有所升高，給予60 mg·kg-1竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，MuRF1表達(dá)明顯降低(P<0.05)，PAX7在脛骨前肌中的表達(dá)變化同樣不明顯。

4　討論

惡病質(zhì)是腫瘤常見(jiàn)的并發(fā)癥，其發(fā)生與宿主體內(nèi)各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝密切相關(guān)。腫瘤從人體固有的脂肪與蛋白質(zhì)中奪取營(yíng)養(yǎng)構(gòu)建自身，形成以浪費(fèi)型代謝為主的狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給小鼠皮下接種結(jié)腸腺癌CT26細(xì)胞建立惡病質(zhì)模型，發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，惡病質(zhì)小鼠去瘤后體重、腓腸肌、脛骨前肌和附睪脂肪重量均明顯下降，血清中TNF-ɑ和 IL-1β水平升高，同時(shí)伴隨骨骼肌中MuRF1表達(dá)增加。作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中的活性物質(zhì)，MuRF1在蛋白質(zhì)降解、肌肉萎縮中發(fā)揮著重要作用。以上系列指標(biāo)變化說(shuō)明惡病質(zhì)小鼠體內(nèi)骨骼肌與脂肪大量丟失，與臨床惡病質(zhì)的表現(xiàn)一致[10]。

Fig 5　Effects of SPJ on protein expression of NF-κB, PAX7 and MuRF1 in tibialis anterior muscle(±s, n=4)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel

目前，針對(duì)腫瘤惡病質(zhì)的治療著重于改善患者體質(zhì)量下降，主要干預(yù)機(jī)制為刺激腫瘤患者食欲，改善機(jī)體營(yíng)養(yǎng)，常用藥物為醋酸甲地孕酮和甲羥孕酮等激素類(lèi)似物[3,11]；沙利度胺通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，降低瘦素對(duì)下丘腦的刺激，降低厭食性肽表達(dá)，改善腫瘤相關(guān)厭食癥，對(duì)腫瘤惡病質(zhì)的治療有一定作用[12]。大量研究證實(shí)，炎性因子可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)脂肪、肌肉的分解代謝，加速惡病質(zhì)進(jìn)程。相關(guān)研究顯示，竹節(jié)參總皂苷具有良好的抗炎活性[8-9,13]。本實(shí)驗(yàn)用竹節(jié)參總皂苷干預(yù)CT26細(xì)胞誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠，結(jié)果表明，竹節(jié)參總皂苷能明顯增加惡病質(zhì)小鼠體重，減少脛骨前肌、腓腸肌、脾臟和附睪脂肪的丟失，降低血清中TNF-α與IL-1炎性因子的表達(dá)，其中對(duì)TNF-α的作用呈劑量依賴性。作為體內(nèi)多種進(jìn)程調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子蛋白，NF-κB能調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1等炎性因子的分泌，且當(dāng)機(jī)體處于炎性環(huán)境時(shí)被大量激活?；罨腘F-κB還能進(jìn)一步激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子FoxO，使MuRF1蛋白表達(dá)，引起肌肉蛋白的降解[14]；同時(shí)抑制PAX7蛋白的表達(dá)，降低MyoD等肌肉分化生長(zhǎng)因子mRNA水平，阻礙受損肌肉組織的修復(fù)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，竹節(jié)參總皂苷有效抑制腫瘤惡病質(zhì)小鼠骨骼肌中NF-κB p65的表達(dá)。以上結(jié)果表明，竹節(jié)參總皂苷能有效改善荷瘤小鼠腫瘤惡病質(zhì)狀態(tài)，其機(jī)制可能與抑制NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)相關(guān)。

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)完成于三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。感謝三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)本課題提供的支持與幫助；感謝王俊濤、劉秀同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的日常記錄；感謝上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院郭澄教授贈(zèng)送CT26細(xì)胞株。)

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