不同固定液對(duì)冷凍組織病理切片HE染色質(zhì)量對(duì)照研究

余燕琪，邊慶華

快速病理診斷中，冷凍切片發(fā)揮著十分重要的作用，冷凍切片的質(zhì)量能夠直接影響到診斷的快速性和準(zhǔn)確性。但是干擾冷凍切片質(zhì)量的因素較多，其中一項(xiàng)最重要的因素就是冷凍切片的固定液選擇，其對(duì)冷凍切片的HE染色質(zhì)量有著十分重要的影響[1]。因此為了選擇出最佳的固定液，本次研究針對(duì)52例冷凍組織病理切片分別采用了4種不同的固定液進(jìn)行固定，并對(duì)所有切片進(jìn)行HE染色，查看其染色效果。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇本院2016年臨床科室術(shù)中送檢的52例新鮮組織參與研究，其中共有36例惡性病變組織，16例良性病變組織，組織來源主要包括甲狀腺、乳腺和肺。

1.2方法將新鮮的組織制成切片，切片制作使用的儀器為德國(guó)Leica CM1950恒冷切片機(jī)。隨后準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)需要使用的4種固定液，分別是丙酮、95%乙醇、AAF液和改良AAF液。其中AAF液是由15 m1 40%甲醛、80 m1 95%乙醇和5 m1冰醋酸構(gòu)成，改良AAF液則是由15 m1福爾馬林、40 m1 95%乙醇、42 m1苦味酸飽和95%乙醇液、3 m1冰醋酸、0.2 m1 Triton構(gòu)成。

使用OCT冷凍包埋劑將新鮮的組織塊進(jìn)行包埋，隨后放入冷凍切片機(jī)，確保組被冷凍至合適的硬度，隨后進(jìn)行組織切片處理，切片厚度為4μm，每個(gè)標(biāo)本需要進(jìn)行4次切片，以形成4張切片，隨后將切片放入4種不同的固定液中，并對(duì)切片進(jìn)行HE染色，染色完成后將切片放置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2　結(jié)果

采用丙酮固定液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下表現(xiàn)出不清晰的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核存在明顯的收縮現(xiàn)象，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的染色效果較差，著色不鮮艷；采用95%乙醇固定液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下能夠看見較清晰的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核存在收縮現(xiàn)象，細(xì)胞核染色模糊，細(xì)胞質(zhì)染色效果不佳，著色不鮮艷；采用AFF液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下可以看到較為清晰的組織結(jié)構(gòu)，但是細(xì)胞核輪廓顯示不清晰，細(xì)胞核的染色效果較佳，但細(xì)胞質(zhì)染色效果不佳，著色不鮮艷；采用改良AFF液進(jìn)行固定的切片，在顯微鏡下可以看到清晰的組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色效果清晰，顏色鮮艷，兩者對(duì)比效果明顯，見表1。

表1　不同固定液對(duì)染色質(zhì)量的影響比較

3　討論

冷凍切片是一種快速制片技術(shù)，在外科手術(shù)和病理科中較為常見，它將病理組織冷凍至一定硬度后再進(jìn)行切片處理[2]。在外科手術(shù)中，借助冷凍切片能夠?qū)δ[瘤性質(zhì)和手術(shù)切緣進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的評(píng)估，從而幫助醫(yī)師快速選擇合理的手術(shù)方式。因此冷凍切片的質(zhì)量對(duì)病理診斷的準(zhǔn)確性和快速性有著決定性的作用。甲狀腺、乳腺和肺是最常見的冷凍組織病理切片送檢標(biāo)本，其中甲狀腺切片容易出現(xiàn)收縮的現(xiàn)象，細(xì)胞核內(nèi)容易出現(xiàn)白色空泡，從而導(dǎo)致空泡和核內(nèi)包涵體出現(xiàn)混淆的情況；同時(shí)成片腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顏色較淡，因此組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)不清晰，觀察時(shí)容易將其誤認(rèn)成毛玻璃核，在進(jìn)行HE染色時(shí)，若染色較淡，則會(huì)難以辨認(rèn)出乳頭軸心，并且對(duì)其的冷凍溫度應(yīng)控制在合理范圍內(nèi)，不得過低[3]。肺組織具有豐富的血供和腔隙，可能會(huì)存在大量壞死或炎性分泌物的情況，因此在進(jìn)行冷凍時(shí)注意控制冷凍時(shí)間，否則可能會(huì)出現(xiàn)假象。乳腺組織在制成冷凍切片時(shí)，需要保證沒有重疊褶皺現(xiàn)象，并確保切片不存在裂隙，使切片保持良好的對(duì)比度，并使組織界限能夠清晰地展露出來，不得對(duì)細(xì)胞核過度染色或深層染色[4]。對(duì)于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀病變組織而言，一般會(huì)同時(shí)存在大汗腺化生的現(xiàn)象，因此在冷凍切片中，細(xì)胞核存在收縮現(xiàn)象，同時(shí)伴有深染現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)的HE染色效果較差，從而對(duì)診斷結(jié)果產(chǎn)生不利影響。另外，肥胖或乳腺萎縮可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)中存在較多的脂肪，在此情況下可以適量降低冷凍的溫度，從而使切片保持完整，避免出現(xiàn)褶皺或者重疊的現(xiàn)象[5]。

進(jìn)行組織固定的目的是將組織蛋白質(zhì)進(jìn)行變性和凝固，使其沉淀，從而使組織和細(xì)胞能夠保持原本的形態(tài)。冷凍切片質(zhì)量好壞的重要影響因素之一是切片固定，如果切片固定效果較差，則再進(jìn)行HE染色時(shí)無法得到預(yù)期的染色結(jié)果[6]。因此本次研究針對(duì)冷凍組織病理切片采用了4種不同的固定液進(jìn)行固定，并對(duì)染色質(zhì)量進(jìn)行分析對(duì)比。其中丙酮和乙醇都是單純性的固定劑，丙酮具有很強(qiáng)的滲透力，能夠使蛋白質(zhì)完全沉淀，但是對(duì)細(xì)胞核沒有很好的固定效果，著色效果較差，并且使用丙酮后細(xì)胞核收縮明顯，容易產(chǎn)生脫片情況；乙醇能夠?qū)⑶衅系乃秩コ瑥亩骨衅慕M織結(jié)構(gòu)得以完好的保存下來，并且能夠使球蛋白、白蛋白、核蛋白完整沉淀，但是核蛋白的沉淀會(huì)在水中溶解，從而使得著色效果不佳，除此之外，乙醇還會(huì)形成一層蛋白膜覆蓋在組織表面，從而使固定液和染液不能很好地滲入，從而對(duì)染色質(zhì)量產(chǎn)生不良影響[7]。單純性固定液在進(jìn)行固定時(shí)不可避免存在一定的局限性，通過一定的比例混合后形成復(fù)合型固定液，則可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，提高固定的質(zhì)量和效果。AFF液和改良AAF液是復(fù)合型固定液，AFF液主要是由乙醇、甲醛和冰醋酸構(gòu)成，冰醋酸具有很強(qiáng)的穿透作用，能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成組織的固定工作，甲醛不會(huì)使組織產(chǎn)生收縮反應(yīng)，固定效果均勻，但是不能使核蛋白沉淀，通過與乙醇的配合可以有效地進(jìn)行脫水和協(xié)同固定，雖然乙醇對(duì)組織細(xì)胞具有一定的收縮作用，但是因冷凍產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)液體膨脹和冰醋酸導(dǎo)致的組織膨脹現(xiàn)象不完全借助乙醇來抑制，因此細(xì)胞核易出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，從而使細(xì)胞核的染色效果不良[8]。因此在此基礎(chǔ)上對(duì)AAF液進(jìn)行了改良工作，加入了苦味酸飽和95%乙醇液和Triton，苦味酸作為一種酸性固定劑，能夠?qū)σ磺械鞍踪|(zhì)產(chǎn)生沉淀作用，并且具有明顯的收縮效果。苦味酸飽和乙醇具有很強(qiáng)的組織收縮性，能夠有效緩解組織膨脹的現(xiàn)象，從而使組織和細(xì)胞能夠保持原有的形態(tài)，也能實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)本的脫水。Triton X-100是一種離子表面活性劑，能夠在短時(shí)間內(nèi)脫去組織和細(xì)胞膜中的脂質(zhì)，從而使細(xì)胞膜的通透性得到有效改善，方便固定液能夠在短時(shí)間內(nèi)深入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，從而提高染色的質(zhì)量。此次研究中，復(fù)合型固定液固定切片的染色效果明顯優(yōu)于單純性固定液，以改良AAF液的固定效果最佳。

綜上所述，固定液的選擇對(duì)于冷凍切片的染色效果有直接影響，采用改良AAF固定液能夠有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)冷凍組織病理切片的固定，能夠有效提升染色質(zhì)量，得到準(zhǔn)確的效果，因此值得臨床推廣。

[1]王曉宇,齊君,孟憲杰,等.不同固定液對(duì)冷凍組織病理切片HE染色質(zhì)量比較[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(2):165-167.

[2]周君,謝明,彭茜茜,等.4種固定液對(duì)快速冷凍切片的制片效果的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程,2016,24(9):32-33.

[3]馮家成,楊靜,張柏輝,等.三種不同固定液和固定方法對(duì)腦組織冷凍切片的影響[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2015,31(5):593-594.

[4]王俊生.探討HE染色方法在臨床病理診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2016,16(68):144,149.

[5]吳平,張聲.無醛固定液與甲醛固定液對(duì)組織形態(tài)學(xué)保存效果比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2015,31(3):343-345.

[6]王曉宇,齊君,孟憲杰,等.不同固定液對(duì)冷凍組織病理切片HE染色質(zhì)量比較[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2016,31(2):165-167.

[7]董蕓蓉.不同固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片固定效果的比較[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(6):710-711.

[8]余鑫鑫,袁靜萍,閻紅琳,等.4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片固定效果的比較[J].診斷病理學(xué)雜志,2016,23(8):630-631.