高效液相色譜法同時測定水源水中三種微囊藻毒素

肖潺潺 方向 梅凡彪 陳茂劍 曾潔 吳玲紅 利基林，3 黃天壬，3 黎遠冬，3 鄧偉，3

人類生產(chǎn)和生活產(chǎn)生的大量氮、磷能引起水體富營養(yǎng)化，當富營養(yǎng)化程度嚴重的水體遇到適合藻類生長的溫度和光照等條件時，會導致藍藻水華頻繁發(fā)生。而毒藍藻水華的爆發(fā)會分泌一種次級代謝產(chǎn)物——藻毒素，可抑制其他物種在水體中生長，以確保藻類本身的生長優(yōu)勢［1］。微囊藻毒素（microcystins，MCs）為單環(huán)七肽毒素，由90多個異構(gòu)體組成［2］，具有強致癌性，若長期飲用含MCs的水，可對人體造成傷害，甚至引起肝癌發(fā)生［3］。水體中最常見的MCs為MC-LR、MC-RR和MC-YR，其中MC-LR毒性大于MC-RR和MC-YR［4］。MCs化學性質(zhì)穩(wěn)定，自然環(huán)境下降解非常緩慢［5］。目前自來水廠傳統(tǒng)的處理工藝如沉淀、混凝、過濾、加氯并不能有效將其去除，飲用自來水的人群也有攝入微囊藻毒素危險［6］。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的抗體與毒素存在交叉反應，可出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對毒素類型鑒別不佳［7-8］。高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）具有良好的分離能力，可對多種微囊藻毒素進行精確地定性和定量測定［7］。但一次分離檢測多種毒素的方法報道較少，且實驗條件差別較大。本研究在以往研究的基礎上，優(yōu)化提取MCLR、MC-RR、MC-YR 3種MCs并采用HPLC同時檢測，以進一步改進和完善水樣中MCs的HPLC檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

LC-20A高效液相色譜儀購自日本島津有限公司，包括LC-20AB高壓泵、SPD-20A紫外線檢測器、CTO-20A柱溫箱，恒溫水浴鍋購自北京西城新瑞儀器廠，真空泵、SUPELCO（500mg/6mL）購自北京康林有限公司，0.45μm有機濾膜購自天津津騰實驗設備有限公司。微囊藻毒素-RR、LR標準品（純度≥97%）購自北京索萊寶科技有限公司，微囊藻毒素-YR標準品（純度≥98%）購自Alexis有限公司。甲醇和乙腈（色譜純）、三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）（分析純）購自南寧科利爾生物有限公司。

1.2 標準樣品配制

MC-RR、MC-LR標準儲備液：將50μg純MC-RR、MC-LR標準物質(zhì)用0.5mL甲醇溶解配制成100μg/mL標準儲備液，MC-YR儲備液10μg/mL，可在1～4℃保存6個月，將MC-RR、MC-LR、MC-YR3種標準品逐級稀釋配制成0.05μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL系列濃度標準溶液，在色譜分析條件下依次測定。

1.3 環(huán)境水樣采集與前處理

水樣采用橫式采水器采集水面下0.5 m處表層水樣，經(jīng)砂芯漏斗去除大顆粒雜質(zhì)，置于4℃避光保存。量取500 mL水樣經(jīng)0.45μm濾膜減壓過濾。胞內(nèi)MCs提取步驟：濾膜在-80℃和37℃反復凍融3次，待測。胞外MCs固相萃取步驟：依次用10mL 100%甲醇、10mL超純水活化固相萃取柱；再將過濾后的水樣流經(jīng)固相萃取柱進行富集濃縮，流速為4.0mL/min；依次用10mL超純水和20mL 20%甲醇溶液淋洗固相萃取柱；以15 mL 80%甲醇溶液（加入0.05%TFA）將固相萃取柱上的MCs洗脫收集。15mL收集液在普通恒溫水浴鍋中60℃水浴，同時緩慢吹入氮氣吹脫，蒸發(fā)濃縮吹干，-20℃冷凍避光保存，待分析。分析前溶于1mL超純水。

1.4 淋洗液、洗脫液、流動相和流動相磷酸的含量選擇

對于淋洗液濃度的選擇，用10 mL超純水淋洗經(jīng)活化處理和上樣濃縮后的小柱，分別采用10%、15%、20%、30%甲醇溶液20mL淋洗固相萃取柱，收集不同濃度的淋洗液，HPLC檢測比較其中的毒素和雜質(zhì)。對于洗脫液的濃度，本實驗在其他條件不變的情況下對比了70%、80%、90%濃度甲醇洗脫液。選擇以下4種流動相進行比較實驗：⑴0.1%磷酸水溶液-乙腈（50∶50）；⑵0.1%磷酸水溶液-乙腈（70∶30）；⑶0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）；⑷0.1%磷酸水溶液-乙腈（65：35）。對以下3種磷酸含量的流動相進行比較實驗：⑴：水溶液-乙腈（67∶33）；⑵：0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）；⑶：0.2%磷酸水溶液-乙腈（67∶33）。采用梯度洗脫方式，對比3種流動相在保留時間、分離度、響應強度方面的差異。

1.5 HPLC測定條件

色譜柱：Inersustain ODS（4.6mm×250.0mm，5μm），在238 nm波長紫外線檢測器檢測，柱溫45℃。流動相：0.1%磷酸水溶液-乙腈（67∶33），流速1.0 mL/min，梯度洗脫，進樣量20μL。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理。分別以MC-RR、MC-LR、MC-YR 3種標準樣品的色譜峰面積為因變量，標準樣品濃度為自變量進行簡單線性回歸分析并計算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 樣品預處理的優(yōu)化

2.1.1 淋洗液的優(yōu)化本實驗采用10%、15%、20%、30%甲醇溶液20mL淋洗固相萃取柱，收集不同濃度的淋洗液，用HPLC檢測比較其中的毒素和雜質(zhì)。經(jīng)比較，20%甲醇淋洗液較合適。

2.1.2 洗脫液的優(yōu)化本實驗在其他條件不變的情況下對比70%、80%、90%濃度甲醇洗脫液，結(jié)果顯示，80%甲醇溶液為洗脫液的方案最佳。

進一步對洗脫步驟中的一些操作細節(jié)進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)洗脫較分批次洗脫效果更佳，但應盡量避免小柱在洗脫過程中吹干。同時，洗脫液中加入TFA對回收率有一定影響，80%甲醇溶液洗脫液中加入0.05%TFA能明顯提高毒素的回收率，特別是MCRR的回收率，而且重現(xiàn)性較好，在同一條件下平行測定6次不同洗脫液的加標回收率，結(jié)果見表1。

表1 不同洗脫液的平均加標回收率比較（n=6，%）

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相及流動方式的選擇由于MCs易溶于水和乙腈，因此選擇水-乙腈作為流動相進行實驗。結(jié)果表明，選擇0.1磷酸水溶液-乙腈（67∶33）流動相峰形好，響應值高，出峰時間快，在20min內(nèi)可較好地分離微囊藻毒素，因此選擇0.1磷酸水溶液-乙腈（67：33）。

2.2.2 流動相磷酸的含量對磷酸含量的流動相進行比較，結(jié)果表明，以水溶液-乙腈（67∶33）流動相分析MCs時保留時間較長，且MC-LR、MC-YR 2種毒素峰形和分離度均較差，加入磷酸后離子化效率明顯增高，出峰時間快，響應強度高，且峰形好。本研究采用0.1磷酸水溶液-乙腈（67：33）流動相（pH值為3），可在20 min內(nèi)分離MC-RR、MC-LR、MC-YR，保留時間分別為7.448 min、15.291 min、18.485 min，結(jié)果見圖1。

2.2.3 標準曲線方程與檢出限按照優(yōu)化后的色譜條件，以色著峰面積對標準樣品濃度求得線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)（表2）和標準曲線（圖2）。按信噪比（S/N）=3計算本方法MC-RR、MC-YR和MC-LR的檢出限（limitof detection，LOD），分別為0.037μg/L、0.056 μg/L和0.028μg/L。

圖1 MC-RR、MC-YR、MC-LR標準樣品液相色譜圖

表2 MC-RR、MC-YR、MC-LR的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖2 HPLC檢測MC-RR、MC-YR、MC-LR的標準曲線

2.2.4 回收率和精密度應用本方法檢測某水源水、末梢水和純水中的MCs，樣本均加入0.1μg/L的MC-RR、MC-LR、MC-YR標準樣品，經(jīng)吸附、洗脫、濃縮處理后，每個樣品在選定的色譜條件下平行測定6次，結(jié)果見表3。其中MC-RR測定結(jié)果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為5.0%～8.2%，平均回收率為80%～100%；MC-YR測定結(jié)果的RSD為6.2%～8.1%，平均回收率為80%～90%；MC-LR測定結(jié)果的RSD為5.4%～9.6%，平均回收率為93%～110%?；厥章示?0%～120%之間，滿足GB 5749-2006《生活飲用水標準檢驗方法水質(zhì)分析質(zhì)量控制》對測量準確度的要求。

表3 HPLC檢測MC-RR、MC-YR及MC-LR的精密度和回收率（n=6）

3 討論

水體富營養(yǎng)化不斷加劇可使有毒藻類大量繁殖，水體中藻毒素特別是MCs污染日益嚴重。由于傳統(tǒng)的處理工藝如沉淀、混凝、過濾、加氯均不能有效將其去除，人們可通過直接接觸、食物鏈傳遞和飲水3種途徑長期低劑量接觸，因此，探討MCs對人類健康的危害尤為必要，而對MCs進行定性和定量是先決條件之一。MCs是細胞內(nèi)毒素，在細胞內(nèi)合成，只有細胞壁破裂后才釋放出來。對其進行檢測時，特定的細胞預處理至關(guān)重要。目前報道較多的破壞細胞壁的方法是反復凍融和超聲破碎機。Ramanan等［9］研究發(fā)現(xiàn)，超聲破碎雖可釋放更多的毒素，但可引起多肽結(jié)構(gòu)斷裂而使其降解，MCs的量并不能明顯增加。所以本實驗在-80℃和37℃反復凍融3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒總量高且省時。

對于淋洗液的選擇，甲醇濃度越低的淋洗液洗脫能力越差，其中雜質(zhì)和毒素含量亦越低［10］。如低于15%的甲醇淋洗液中只含少量色素等雜質(zhì)，保留在小柱中的雜質(zhì)勢必造成后續(xù)檢測中MCs峰被嚴重干擾。而濃度為30%的甲醇淋洗液中雜質(zhì)含量最大，色譜圖起始基線很高，但同時又有少量MC-RR、MC-YR被洗脫檢出，導致后續(xù)檢測中毒素回收率偏低。本研究發(fā)現(xiàn)20%的甲醇淋洗液較為合適。

對于洗脫液濃度的選擇，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)用濃度為90%的甲醇溶液洗脫，其洗脫收集液的色譜圖上雜質(zhì)較多，毒素峰被嚴重干擾。而70%和80%甲醇洗脫液洗脫效率較接近，70%甲醇洗脫液的回收率略高，但考慮到后續(xù)濃縮步驟70%甲醇溶液洗脫下毒素的收集液較難吹干，因為洗脫劑中水相比例增加會使蒸發(fā)濃縮過程時間增加幾倍，延長實驗周期，綜合考慮省時、低干擾以及高回收等因素，發(fā)現(xiàn)以80%甲醇溶液作為洗脫液最佳。TFA可調(diào)節(jié)pH值，促進MCs多肽質(zhì)子化，并與之形成離子對，削弱MCs多肽與硅膠表面硅醇基的相互作用力，使其更易被洗脫［10］。而且TFA的紫外背景吸收小，易揮發(fā)，也有利于減少分析干擾。所以本實驗在80%甲醇溶液洗脫液中加入0.05%TFA，結(jié)果能明顯提高毒素的回收率和減少雜質(zhì)干擾。

理論上，HPLC譜可分辨出幾十種肽的混合物，但實際上分析、分離微小差別異構(gòu)體的混合物仍非常困難，因此在分離這一類化合物時通常使用酸性流動相以提高色譜效率。比如加入磷酸調(diào)節(jié)流動相，較低的pH值可使肽中的羧酸基質(zhì)子化，增加電離效果［11］。有報道［12-13］，隨著水-乙腈流動相酸度增大，可明顯改善MCs峰形，但MC-RR出峰過早會和實際樣品中先出來的雜質(zhì)混合，而且色譜柱也有一定的耐酸限度，因此要選擇合適的酸度，既要有較好的峰形和分離度，也要對色譜柱加以保護。本實驗采用0.1磷酸水溶液-乙腈（67∶33）流動相（pH值為3），可在20 min內(nèi)分離MC-RR、MC-LR、MC-YR，保留時間分別為7.448min、15.291 min、18.485 min，在0.05～1.0μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回收率均在80%～110%之間，RSD為5.0%～9.6%，LOD分別為0.37、0.028和0.056μg/mL，說明本法可行、有效。

本實驗采用優(yōu)化的HPLC方法同時測定水樣中MC-LR、MC-RR和MC-YR，萃取時采用20%的甲醇溶液淋洗，80%甲醇溶液（加入0.05%TFA）洗脫，能明顯提高MCs回收率，且重現(xiàn)性好。HPLC進樣分析選用0.1%磷酸水溶液-乙腈（67：33）作為流動相進行梯度洗脫，對MC-LR、MC-RR和MC-YR分離效果較好，保留時間適中。本法解決了圖譜雜質(zhì)多，目標化合物的色譜峰分離不理想的問題，同時靈敏度高，精密度、準確度滿足現(xiàn)行國內(nèi)及國際水質(zhì)檢測標準要求，對微囊藻毒素HPLC檢測技術(shù)的推廣應用具有重要參考價值。

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