纈沙坦對阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的初步研究

劉麗文 陽志軍 俸艷英

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種有效且常用于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤化療的蒽環(huán)類藥物［1］，心臟毒性是蒽環(huán)類藥物最常見和不可避免的毒副作用［2］，因此在腫瘤化療中的使用有累積劑量限制，其心臟毒性的預(yù)防和管理是目前研究關(guān)注的臨床熱點(diǎn)問題之一。然而，DOX引起心臟毒性的機(jī)制尚未明確，其中氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡可能是重要的機(jī)制［3］。氧化應(yīng)激是指機(jī)體遭受各種有害物質(zhì)刺激時(shí)，組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多且清除能力降低，導(dǎo)致機(jī)體氧化和抗氧化能力失衡，與多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］。目前研究認(rèn)為阿霉素致心肌損害是由于蒽環(huán)類藥物螯合鐵離子后觸發(fā)超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）等活性氧生成，導(dǎo)致羥基自由基形成，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，引起心肌細(xì)胞損傷［5］。有研究顯示抗氧化劑處理對阿霉素介導(dǎo)的心臟毒性起保護(hù)作用［6］。而細(xì)胞凋亡是由基因控制的一種有序的自主死亡過程，也是導(dǎo)致心肌損傷的主要方式，是擴(kuò)張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）心力衰竭、心肌細(xì)胞丟失和心功能不全的重要機(jī)制［7］。

纈沙坦（valsartan，VAT）是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡreceptor antagonists，ARBs），對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，ARBs可選擇性作用于心臟的AT1受體，逆轉(zhuǎn)心室和血管壁重構(gòu)，促進(jìn)心臟功能恢復(fù)［8］。越來越多的研究表明，ARBs同時(shí)具有抗炎、降低心肌細(xì)胞凋亡水平等作用，可減弱阿霉素誘導(dǎo)的心臟功能障礙［9］。本研究采用DOX作用于H9C2心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞損傷模型，初步探討VAT保護(hù)DOX所致的心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

H9C2心肌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counter kit-8，CCK-8）購自日本Dojindo Lab公司，DOX購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，纈沙坦片購自海南皇隆制藥股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基、特級胎牛血清（FBS）均購自美國Coring公司，流式凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司，流式周期檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2心肌細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEN培養(yǎng)基中。

1.3 CCK-8法檢測H9C2心肌細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，胰酶消化后按1250個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至80%融合度，以PBS處理的H9C2心肌細(xì)胞為對照組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行以下處理：⑴分別給予不同濃度（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L）的DOX培養(yǎng)12 h和24 h；⑵分別給予不同濃度（5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L）VAT預(yù)處理24 h后，PBS洗滌2次，再用上述確定的最佳DOX濃度培養(yǎng)24 h；⑶采用前兩個(gè)步驟確定的DOX及VAT濃度處理H9C2心肌細(xì)胞，觀察不同作用時(shí)間（12h、24 h、36 h和48 h）其對H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響；每個(gè)處理因素設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。以PBS處理的H9C2心肌細(xì)胞為對照組。終止培養(yǎng)后，每孔加入10μLCCK-8，輕搖，37℃孵育90min，采用酶標(biāo)儀（λ=450）記錄各孔吸光度（OD值）。按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測H9C2心肌細(xì)胞凋亡率

H9C2心肌細(xì)胞按5×105個(gè)/孔接種于6孔板，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%融合度，按實(shí)驗(yàn)需要分別處理H9C2心肌細(xì)胞：對照組為PBS處理的H9C2心肌細(xì)胞，DOX組給予1μmol/L DOX，DOX+VAT組給予1μmol/L DOX+10μmol/L VAT，VAT組給予10μmol/L VAT。PBS清洗后0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，按試劑盒提供的步驟進(jìn)行PI-Annexin V染色，流式細(xì)胞儀檢測H9C2心肌細(xì)胞凋亡率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測H9C2心肌細(xì)胞周期

將H9C2心肌細(xì)胞饑餓24 h后接種至培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至約80%融合度，按實(shí)驗(yàn)要求分別處理H9C2心肌細(xì)胞：對照組為PBS處理的H9C2心肌細(xì)胞，DOX組給予1μmol/L DOX，DOX+VAT組給予1μmol/LDOX+10μmol/LVAT，VAT組給予10μmol/L VAT。PBS清洗后0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，以1000 r/min離心5min，棄上清液；預(yù)冷PBS再洗滌2次，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷75%乙醇4℃固定細(xì)胞，第2天PBS水化、洗滌細(xì)胞，棄PBS，殘留PBS約50μL重懸細(xì)胞，加入RNA酶100μL，置于37℃水浴鍋孵育30min；最后加入400μL PI染液4℃避光染色60 min，在流式分析儀上檢測分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOX對H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響

0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L濃度下的DOX作用H9C2心肌細(xì)胞12 h后，細(xì)胞存活率分別為（93.1±2.5）%、（89.0±1.3）%、（87.5±2.8）%、（85.5±2.2）%；作用24 h后，細(xì)胞存活率分別為（84.5±4.4）%、（75.5±5.6）%、（67.4±2.9）%、（60.4±2.9）%。與對照組的細(xì)胞存活率100%比較，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各濃度DOX作用H9C2心肌細(xì)胞，其細(xì)胞存活率均降低（P＜0.01），且隨藥物濃度增加，細(xì)胞存活率越低。DOX作用于H9C2心肌細(xì)胞24 h的IC50值為（8.44±1.38）μmol/L，IC25值為（1.32±0.47）μmol/L。

2.2 DOX對H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L）DOX處理H9C2心肌細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，0.5μmol/L DOX作用可引起H9C2心肌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為（8.44±1.12）%，但與對照組細(xì)胞凋亡率（4.86±0.59）%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)DOX濃度為1μmol/L、2μmol/L時(shí)，H9C2心肌細(xì)胞凋亡率分別為（11.94±2.07）%、（17.86±5.11）%，與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度DOX對H 9C2心肌細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 不同濃度VAT作用24 h對H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響

不同濃度（5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L）VAT作用24 h后，H9C2心肌細(xì)胞存活率分別為（99.1±1.0）%、（99.0±2.0）%、（102.2±6.0）%，與對照組的細(xì)胞存活率100%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 VAT預(yù)處理對DOX所致H9C2心肌細(xì)胞毒性的影響

1μmol/L DOX作用H9C2心肌細(xì)胞前，分別用5 μmol/L、10μmol/L、15μmol/L VAT預(yù)處理24 h，細(xì)胞存活率分別為（84.5±4.1）%、（89.3±4.0）%、（88.9±3.9）%，與1μmol/L DOX組的細(xì)胞存活率（74.2±3.1）%比較，各組細(xì)胞存活率升高（P＜0.01），其中當(dāng)VAT濃度為10μmol/L時(shí)保護(hù)作用最大。用10μmol/L的VAT分別預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞12 h、24 h、36 h和48 h，細(xì)胞存活率分別為（87.9±0.6）%、（92.1±0.6）%、（91.2±0.5）%、（88.7±0.5）%，與作用24 h相比，縮短或延長作用時(shí)間細(xì)胞存活率并未顯著提高（P＞0.05）。

2.5 VAT對DOX引起的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，1μmol/L DOX作用H9C2心肌細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率為（13.15±6.07）%，對照組為（4.85±5.65）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；1μmol/L DOX處理細(xì)胞前用濃度為10μmol/L VAT預(yù)處理24 h，細(xì)胞凋亡率為（11.10±3.17）%，與1μmol/L DOX比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單用10μmol/L VAT所致的細(xì)胞凋亡率為（6.57±3.22）%，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1μmol/LDOX+10 μmol/LVAT作用所致的細(xì)胞凋亡率高于10μmol/L VAT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（11.10±3.17）%vs（6.57±3.22）%，P＜0.05］，見圖2。

2.6 VAT對DOX作用后H9C2心肌細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，1μmol/L DOX作用24 h后G0/G1期的心肌細(xì)胞所占比例明顯高于對照組［（69.21±2.03）%vs（43.12±2.34）%，P＜0.01］；而G2/M期細(xì)胞所占比例明顯低于對照組［（7.87±1.55）%vs（24.2±1.21）%，P＜0.01）］；1μmol/L DOX作用H9C2心肌細(xì)胞前，用10μmol/L VAT處理24h后G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯低于1μmol/LDOX組［（50.28±1.21）%vs（69.21±2.03）%，P＜0.01）］，而G2/M期細(xì)胞所占比例明顯高于1μmol/L DOX組［（14.5±1.57）%vs（7.87±1.55）%，P＜0.01）］；10μmol/L VAT處理H9C2心肌細(xì)胞，與對照組相比，各期細(xì)胞所占比例變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 VAT對DOX引起的H 9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

阿霉素在臨床上廣泛應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等惡性腫瘤化療，但過量阿霉素可導(dǎo)致心肌病和慢性充血性心力衰竭等嚴(yán)重心臟毒性［2］。目前認(rèn)為阿霉素心臟毒性機(jī)制包括活性氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡等［3］。心肌細(xì)胞凋亡是多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理機(jī)制之一，其信號傳導(dǎo)通路相互影響，組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)阿霉素誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡呈劑量與時(shí)間依賴性，當(dāng)DOX濃度為1μmol/L時(shí)，作用24 h后H9C2心肌細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為H9C2心肌細(xì)胞生長抑制、凋亡增加，細(xì)胞存活率下降至（75.5±5.6）%，細(xì)胞凋亡率由對照組的（4.86±0.59）%上升到（11.94±2.07）%。近期研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可能主要通過激活心肌氧化應(yīng)激，促進(jìn)活性氧蓄積等途徑引起心肌細(xì)胞凋亡［11-12］。

圖3 VAT對DOX作用后H9C2心肌細(xì)胞周期的影響

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在心血管系統(tǒng)生理調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，并與多種心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)［13］。研究顯示RAS系統(tǒng)參與心肌損傷的過程［14］。VAT是一種血管緊張素受體Ⅱ抑制劑，具有抗炎、減低心肌細(xì)胞凋亡水平的作用。姚艷等［15］研究氯沙坦長期干預(yù)心衰，發(fā)現(xiàn)其能改善心臟舒縮功能。本研究發(fā)現(xiàn)在DOX處理前采用10μmol/L VAT預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞24 h，可明顯抑制1μmol/L DOX引起的心肌細(xì)胞毒性作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高、細(xì)胞凋亡率下降、G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少。VAT作為一種ARB類藥物，主要通過與AT1受體結(jié)合，競爭性抑制血管緊張素Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)而發(fā)揮作用。具體機(jī)制可能包括以下方面：⑴纈沙坦作為血管擴(kuò)張劑降低心臟的前后負(fù)荷和室壁張力，改善促使心室重構(gòu)的血流動(dòng)力異常；⑵抑制心肌細(xì)胞凋亡、肥大和膠原增生；⑶抑制交感神經(jīng)過度激活；⑷增強(qiáng)血管緊張素Ⅱ受體的良性心血管效應(yīng)；⑸抑制炎癥因子等［16-17］。Akolkar等［18］報(bào)道給予纈沙坦13周可改善阿霉素誘導(dǎo)的小鼠心臟毒性。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對含蒽環(huán)類藥物化療方案抗腫瘤治療中導(dǎo)致的心臟毒性有潛在的心臟保護(hù)作用［19］。在最近一項(xiàng)薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，接受蒽環(huán)類方案的腫瘤患者使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或ARBs預(yù)防性給藥，與安慰劑相比，發(fā)生心臟毒性的相對風(fēng)險(xiǎn)為0.11［20］，但相關(guān)機(jī)制仍不明確。因此，闡明ARBs保護(hù)阿霉素所致心肌毒性的相關(guān)機(jī)制對于阿霉素的臨床應(yīng)用及心臟毒性防治至關(guān)重要。但VAT通過何種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡而發(fā)揮保護(hù)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)機(jī)制尚未知，需進(jìn)一步深入研究。

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