CAR-T細(xì)胞制備過程中磁珠法激活T細(xì)胞條件的優(yōu)化

張章，邱順芳，2，王瀟霖，丁乾，王晶，于長明，徐俊杰，張曉鵬

1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；2.安徽大學(xué) 健康科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥230000

近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤免疫治療技術(shù)也取得了質(zhì)的飛躍。尤其隨著針對免疫檢查點(diǎn)（CTLA-4 抗原和PD-1 抗原）單抗藥物[1]的問世，以及特異性靶向腫瘤抗原的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾的T細(xì)胞免疫治療的崛起[2-3]，免疫治療技術(shù)已得到醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)同，甚至被認(rèn)為是腫瘤治療領(lǐng)域中最有前景的癌癥治療方法。但不管是免疫檢查點(diǎn)單抗治療[4]還是以CAR-T 細(xì)胞療法為“先鋒”的過繼性免疫治療，T 細(xì)胞都是抗腫瘤免疫過程中的核心執(zhí)行者[5]。CAR-T 免疫治療需要對患者自身的T 細(xì)胞進(jìn)行基因工程改造，使其表達(dá)可特異性識別腫瘤細(xì)胞的CAR[6-9]，并在體外擴(kuò)增后，回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)發(fā)揮治療腫瘤的作用。CAR-T 細(xì)胞治療在臨床上展現(xiàn)出很好的持久性、腫瘤殺傷能力、靶向性[10-11]及增殖能力[12]，被人們寄予厚望。

在CAR-T 細(xì)胞制備過程中，T 細(xì)胞的激活和擴(kuò)增是一個(gè)關(guān)鍵步驟，會影響CAR-T 細(xì)胞的制備周期和最終CAR-T 細(xì)胞的狀態(tài)。常規(guī)的T 細(xì)胞激活方式是通過抗CD3 和CD28 的抗體刺激，或?qū) 細(xì)胞與包被anti-CD3/CD28 的磁珠共同孵育。Tumaini 等[13]同時(shí)比較了2 種T 細(xì)胞激活方法，發(fā)現(xiàn)磁珠法可避免中間分離步驟，且產(chǎn)生的總擴(kuò)增倍數(shù)也高于OKT3（抗CD3 的抗體）激活。之前的研究也顯示，抗CD3 和CD28 的抗體刺激可以產(chǎn)生適度的T 細(xì)胞激活[14]，而磁珠可提供類似天然抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cells，APCs）的作用，激活能力可極大地增強(qiáng)[15-16]。然而，不同的磁珠激活條件可能會影響T 細(xì)胞的激活效果，但目前針對其激活條件優(yōu)化的相關(guān)研究報(bào)道較少。在本研究中，我們分析比較了3 種T細(xì)胞激活條件對激活早期細(xì)胞活力、CD3+T 細(xì)胞所占比例和T 細(xì)胞增殖速度的影響，從而優(yōu)化T細(xì)胞激活條件，以在較短的時(shí)間內(nèi)制備獲得CAR-T 細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

青霉素-鏈霉素（雙抗）、胎牛血清（FBS）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、磷酸緩沖液（PBS）、Gluta?MAX-1（100×）、AIM-V CTS、Dynabeads CD3/CD28 CTS均購自Life Technologies公司；Ficoll-Paque PLUS購自GE公司；APC-isotype、APC antihuman CD3購自Biolegend公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板、AO/PI 染料 購自Biolegend公司；Cellometer Auto 2000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和Guava easyCyte流式細(xì)胞儀分別為Nexcelom和Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

在知情同意情況下，從健康志愿者體內(nèi)采集新鮮血液，負(fù)壓抽取到采血抗凝管中。全血經(jīng)PBS 等體積稀釋后，沿著離心管壁緩慢覆蓋在Fi?coll-Paque PLUS 上層，用密度梯度離心法分離獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞（human peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），每10 mL 肝素化全血經(jīng)處理后可得到約1×107PBMCs。經(jīng)過2 次洗滌細(xì)胞，分離后的PBMCs 用含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素、1% Glutamax-1 和100 IU/mL IL-2 的AIM 培養(yǎng)基重懸，于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 后更換新鮮培養(yǎng)基。所有PBMCs 或直接用于實(shí)驗(yàn)；或重懸于含90% FBS 和10%DMSO 的凍存液中，于-80℃凍存。

1.3 T細(xì)胞激活

T 細(xì)胞激活采用結(jié)合有抗CD3 和抗CD28 抗體的磁珠實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1200 r/min 離心5 min 收集獲得PBMCs，再將PBMCs 與磁珠數(shù)按一定的比例混合（兩者的比例分別為1∶3、1∶1、3∶1），用5% FBS 重懸細(xì)胞至終濃度為1×108/mL，在22℃室溫下，以3 r/min 的速度放于垂直混合儀上充分混勻約30 min，孵育完成后的T 細(xì)胞再次計(jì)數(shù)，并以5×105～10×105/mL 的密度用AIM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 T細(xì)胞計(jì)數(shù)

用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測不同激活條件下的T 細(xì)胞活力及活細(xì)胞數(shù)。取出15 μL 吹吸混勻的細(xì)胞懸液，與相同體積的AO/PI 染料混勻，向計(jì)數(shù)板的加樣孔中加入約20 μL 兩者混合液，在“immuno cell，low RBC”模式下，獲得活細(xì)胞密度及直徑等相關(guān)信息。按照下式分別計(jì)算活細(xì)胞總數(shù)和T 細(xì)胞活力：

圖1 不同激活條件下PBMCs 的活力及細(xì)胞直徑分布

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+T細(xì)胞比例

用流式細(xì)胞儀檢測CD3+T 細(xì)胞比例。分別在T 細(xì)胞激活前后收集細(xì)胞，置于流式管中，洗滌3 次后用100 μL PBS 重懸細(xì)胞，分別向管中加入APC 標(biāo)記的anti-human CD3 抗體及Isotype 對照抗體，4℃避光染色30 min，再次將細(xì)胞清洗3 次以除去游離染料，用300 μL PBS 重懸細(xì)胞，用Gua?va 流式儀檢測，用相關(guān)軟件分析得到的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 激活條件對細(xì)胞活力的影響

將細(xì)胞與磁珠于22℃共孵育30 min，使得兩者充分接觸。3 種激活條件下的細(xì)胞用AO/PI 染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析結(jié)果如圖1A。孵育30 min后，隨著磁珠數(shù)的增加，細(xì)胞活力呈遞減趨勢。當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為3∶1 時(shí)，細(xì)胞活力約為70%；當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，細(xì)胞活力為60%左右；而當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶3 時(shí)，活力僅為55%左右。

同時(shí)，我們也檢測了不同激活條件下細(xì)胞的直徑。細(xì)胞直徑是表征細(xì)胞大小及狀態(tài)的重要參數(shù)。經(jīng)過短暫的激活后，不同激活條件下的活細(xì)胞主要直徑范圍稍有差別（圖1B）。激活前，活細(xì)胞主要直徑范圍為7.7～9.7 μm，此范圍細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的80%以上；PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為3∶1 時(shí)，活細(xì)胞主要直徑范圍為9.7～10.7 μm，范圍內(nèi)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的50%左右；PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，主要直徑范圍為8.7～9.7 μm，占細(xì)胞總數(shù)的33%左右；而PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶3 時(shí)，主要直徑范圍為7.7～8.7 μm，目標(biāo)細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的25.7%左右。然而，4 種情況下，死細(xì)胞直徑范圍基本一致。以上結(jié)果表明，經(jīng)磁珠短暫孵育激活，對PBMCs 的細(xì)胞活力會有較大影響。

圖2 不同激活條件下的淋巴細(xì)胞群分離

2.2 磁珠比例對激活早期CD3+T細(xì)胞的影響

PBMCs 中的T 細(xì)胞是CAR-T 細(xì)胞治療的核心執(zhí)行者，因此我們接下來著重分析了3 種激活條件對CD3+T 細(xì)胞的影響。如上所述，細(xì)胞與磁珠按一定比例混勻孵育后，分別進(jìn)行抗CD3 抗體標(biāo)記，并用流式細(xì)胞儀檢測。首先通過FSC/SSC（前向散射光/側(cè)向散射光）分離淋巴細(xì)胞群，結(jié)果如圖2。激活前的淋巴細(xì)胞占總細(xì)胞的24.2%；而激活后，淋巴細(xì)胞群的比例隨著用于T 細(xì)胞激活的磁珠數(shù)目不同而有所變化。當(dāng)PBMCs 與磁珠比例為3∶1 時(shí)，淋巴細(xì)胞總數(shù)占PBMCs 總數(shù)的29.6%；當(dāng)PBMCs 與磁珠比例為1∶1 時(shí)，淋巴細(xì)胞數(shù)占14.2%；而當(dāng)PBMCs 與磁珠比例為1∶3 時(shí)，淋巴細(xì)胞數(shù)僅占6.05%。

隨后，進(jìn)一步檢測了3 種激活條件下CD3+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例，結(jié)果如圖3。相對于同型對照而言，激活前的CD3+T 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的64.5%；而隨著用于T 細(xì)胞激活的磁珠增加，激活后CD3+T 細(xì)胞的比例也呈遞減趨勢。當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為3∶1 時(shí)，CD3+T 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的60%左右；當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，CD3+T 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的34.1%；而當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶3 時(shí)，CD3+T 細(xì)胞卻只占淋巴細(xì)胞總數(shù)的28.1%左右。這一結(jié)果表明，用于T 細(xì)胞激活的anti-CD3/CD28磁珠數(shù)目過多，會導(dǎo)致CD3+T 細(xì)胞死亡，而這也是導(dǎo)致PBMCs 整體活力降低的主要原因。

2.3 T細(xì)胞激活對增殖的影響

好的激活條件應(yīng)當(dāng)能有效促進(jìn)T 細(xì)胞增殖，而這會影響整個(gè)CAR-T 細(xì)胞制備的周期?；诖?，我們檢測了不同激活條件對細(xì)胞增殖速度的影響。PBMCs 與磁珠孵育30 min 后，3 種激活條件處理的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)15 d。通過在不同培養(yǎng)時(shí)間下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)（孵育30 min 后計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞總數(shù)作為第0 d 細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)3 種激活條件下的T 細(xì)胞生長趨勢大體一致（圖4）。在激活后培養(yǎng)的初期（0～3 d），3 種激活條件下的細(xì)胞總數(shù)基本無變化，細(xì)胞總體處于生長緩慢的適應(yīng)期；培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)入快速生長期。其中，以PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)細(xì)胞增殖最為明顯，連續(xù)檢測至15 d，細(xì)胞仍處于快速生長期，而且在第15 d 時(shí)細(xì)胞數(shù)已擴(kuò)增約50 倍；而其他2 種條件下的T 細(xì)胞，在培養(yǎng)8 d 之內(nèi)細(xì)胞數(shù)都沒有明顯增長，培養(yǎng)至15 d 時(shí)細(xì)胞總數(shù)擴(kuò)增了僅約15 倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 進(jìn)行T 細(xì)胞激活時(shí)，更利于T 細(xì)胞的擴(kuò)增。

圖3 不同激活條件下CD3+ T 細(xì)胞所占比例

圖4 不同激活條件下T 細(xì)胞生長曲線

3 討論

CAR-T 細(xì)胞的制備過程包括PBMCs 分離、激活及外源基因?qū)氲炔襟E，其中T 細(xì)胞的激活是細(xì)胞增殖及CAR-T 細(xì)胞制備的基礎(chǔ)。天然T 細(xì)胞的活化、增殖和分化需要2 種信號：第一種是T細(xì)胞表面受體（TCR）同抗原呈遞細(xì)胞上的MHC/抗原復(fù)合物的特異性相互作用，此信號是必需的，但不能充分激活細(xì)胞；第二種是共刺激信號，通過T 細(xì)胞表面的共刺激受體（如CD28、4-1BB、OX-40）與靶細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞表面相應(yīng)配體（如B7、4-1BBL、OX-40L）的結(jié)合。這一信號對于IL-2/IL-2R 的誘導(dǎo)表達(dá)及T 細(xì)胞增殖分化為成熟的效應(yīng)T 細(xì)胞而言，都是至關(guān)重要的[17]。而從血液中分離獲得的人外周血淋巴細(xì)胞，與包被抗CD3 和CD28 抗體的磁珠結(jié)合后，可同時(shí)為T 細(xì)胞提供激活和擴(kuò)增所需的初始及共刺激信號。已有研究表明，這種方式可以有效地在體外激活T細(xì)胞。目前各種研究中多將3 倍PBMCs 數(shù)量的磁珠直接加入T 細(xì)胞培養(yǎng)基中[18-19]。

本研究采用PBMCs 與磁珠在高密度條件下于22℃孵育30 min 的方式對T 細(xì)胞進(jìn)行激活，PBMCs 與磁珠的比例分別為3∶1、1∶1 和1∶3。研究結(jié)果顯示，磁珠比例增加，會導(dǎo)致CD3+T 細(xì)胞大量死亡。其原因可能是過多的磁珠導(dǎo)致重復(fù)的T 細(xì)胞激活，從 而誘導(dǎo)Fas 和FasL 以及FLIP 的表達(dá)，最終引起激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。此外，營養(yǎng)限制、有毒廢物累積或細(xì)胞臨界培養(yǎng)密度限制等也是影響細(xì)胞活力的潛在因素[20]。而且，過多的磁珠激活會影響用于進(jìn)一步培養(yǎng)的T 細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)估算，從健康志愿者體內(nèi)獲得10 mL 新鮮血液（大約能分離獲得1×107PBMCs），采用PBMCs 與磁珠比例為1∶3 的條件激活細(xì)胞時(shí)，激活30 min 后最終可用于進(jìn)一步培養(yǎng)的CD3+T 淋巴細(xì)胞數(shù)只有1.7×105左右；而當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，得到的T 淋巴細(xì)胞數(shù)可達(dá)4.85×105左右。更重要的是，激活條件還會影響T 細(xì)胞的增殖速度。當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，T 細(xì)胞擴(kuò)增速度是其他2 種條件下的3 倍。這可能與當(dāng)磁珠數(shù)用量過多時(shí)，導(dǎo)致其他單核細(xì)胞的丟失有關(guān)。因?yàn)檠芯勘砻魑捶蛛x的淋巴細(xì)胞比純化的T 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)更有優(yōu)勢，大量存在的單核細(xì)胞會通過結(jié)合T 細(xì)胞表面分子和釋放細(xì)胞因子（通過旁分泌和自分泌的方式）來共激活T 細(xì)胞[21-22]，從而促進(jìn)T 細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等功能。

值得注意的是，1∶3的PBMCs與磁珠比是CAR-T 細(xì)胞相關(guān)研究常用比例[23-25]。但本研究結(jié)果顯示，在這一激活條件下，整體細(xì)胞活力和CD3+T 細(xì)胞比例都是最弱的，T 細(xì)胞增殖速度也并不突出。而當(dāng)PBMCs 與磁珠比為3∶1 時(shí)，細(xì)胞活力和CD3+T 細(xì)胞比例方面最好，但這是以T 細(xì)胞的不能充分激活為代價(jià)的，這一條件下需要更長的時(shí)間使T 細(xì)胞進(jìn)入快速增長期。PBMCs 與磁珠比為1∶1 時(shí)磁珠激活T 細(xì)胞的效果更好，所以即使起始擴(kuò)增的T 細(xì)胞數(shù)相對于3∶1 時(shí)較少，T 細(xì)胞的增長速度仍最快。而1∶3 可能會導(dǎo)致過多的磁珠刺激，引發(fā)T 細(xì)胞死亡和單核細(xì)胞丟失。這說明1∶3 并不是T 細(xì)胞激活的最適條件。

綜上所述，我們用包被抗CD3 和CD28 抗體的磁珠激活T 細(xì)胞，通過比較3 種激活條件，發(fā)現(xiàn)PBMCs 與磁珠比例在早期即對細(xì)胞活力、CD3+T細(xì)胞比例以及細(xì)胞增殖速率有較大影響，并提供了一個(gè)相對于現(xiàn)行方法更佳的PBMCs 與磁珠比例。當(dāng)PBMCs 數(shù)與磁珠數(shù)比例為1∶1 時(shí)，有利于T 細(xì)胞的快速擴(kuò)增，這對于在較短時(shí)間內(nèi)獲得足夠的T 細(xì)胞，縮短整個(gè)CAR-T 細(xì)胞制備周期具有較重要的意義。