變異冬紅果無(wú)菌體系的建立

韋 晨，王 醒

(1.江蘇大學(xué)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇藝軒園林景觀工程有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212000)

冬紅果(Malusspectabilis)是薔薇科蘋果屬落葉灌木或小喬木，因其掛果期可延至第2年2—3月，故又名長(zhǎng)壽果。冬紅果喜陽(yáng)光充足和涼爽干燥的環(huán)境，適宜在含腐殖質(zhì)豐富、疏松肥沃、排水良好的沙質(zhì)土壤中生長(zhǎng)；植株較矮小，樹型緊湊，花淺粉紅色，傘房花序，春季開放；果實(shí)呈簇狀，圓球形或扁圓形，秋季成熟，果色初為綠色，后轉(zhuǎn)黃色，最后呈鮮紅色，具有較高的觀賞價(jià)值，是培育觀果盆景的極佳樹種[1-2]。江蘇大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)裝備與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在冬紅果的栽培過(guò)程中發(fā)現(xiàn)1株變異冬紅果，該變異株不僅葉片呈紫色，而且果實(shí)初期亦呈紫色，至深秋果色由紫入紅，寓意萬(wàn)紫千紅，前期的紫葉紫果既增添了色彩變化的多樣性，滿足了人們對(duì)觀賞植物新、特、奇的要求，又在一定程度上使得觀果期向前延伸，因此，具有這一特異性狀的冬紅果變異植株更具市場(chǎng)潛力。

采用傳統(tǒng)的嫁接繁育技術(shù)不僅使變異冬紅果優(yōu)良性狀難以保存，而且使繁殖效率較低，極大地限制了變異冬紅果的優(yōu)樹選育和規(guī)模化擴(kuò)繁。而組織培養(yǎng)繁殖方法，不僅可對(duì)變異母本的優(yōu)良性狀進(jìn)行保持、提純或復(fù)壯，而且離體培養(yǎng)下繁殖體個(gè)體小、群體大，且可控的環(huán)境還能消除季節(jié)因素的限制，從而顯著地提高繁殖系數(shù)[3-4]。因此，組織培養(yǎng)繁殖方法在變異冬紅果的繁殖方面優(yōu)勢(shì)明顯。目前有關(guān)冬紅果組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的報(bào)道鮮見。而對(duì)蘋果屬植物組織培養(yǎng)進(jìn)行消毒處理時(shí)，大多會(huì)選用75%乙醇和0.1%或0.05%氯化汞消毒，也有用0.1%氯化汞單獨(dú)消毒，均能達(dá)到很好的消毒效果[5-8]。另外，為達(dá)到相同的消毒效果，通常隨消毒劑濃度的降低，消毒時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。如在研究不同消毒方法對(duì)辣木外植體的影響時(shí)，結(jié)果表明氯化汞濃度越低，消毒時(shí)間越長(zhǎng)，才與短時(shí)間高濃度的氯化汞溶液達(dá)到相似的消毒效果，否則，污染率相對(duì)較高[9]。但是，不同種類的蘋果屬植物組培時(shí)，無(wú)論是消毒劑種類及其濃度選擇，還是消毒時(shí)間的確定，均存在一定差異，因此對(duì)于每一種蘋果屬植物均需通過(guò)一系列的篩選比較，優(yōu)化出較為適宜的消毒方法。筆者以變異冬紅果莖段為外植體，比較不同消毒劑濃度和消毒時(shí)間，研究其無(wú)菌體系的建立，以期為變異冬紅果增殖和生根培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料以采自江蘇藝軒園林景觀工程有限公司的1株變異冬紅果新萌發(fā)的帶芽莖段為外植體；消毒試劑為乙醇和氯化汞。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的處理與清洗。剪取變異冬紅果新抽生的嫩枝，除去葉片，留取4 cm左右?guī)б秆康那o段，用洗衣粉水浸泡3～5 min，流水下沖洗30～60 min，沖洗干凈后備用。

1.2.2外植體的消毒。乙醇(75%)、氯化汞(0.1%)配合使用進(jìn)行消毒，消毒后用無(wú)菌水沖洗3～4次；使用氯化汞(0.1%)消毒 6、7、8、9 min，消毒后用無(wú)菌水沖洗3～4次；當(dāng)消毒劑濃度降低時(shí)，為達(dá)到相同的消毒效果，需要相應(yīng)地延長(zhǎng)消毒時(shí)間，因此，使用氯化汞(0.05%)選取的消毒時(shí)間為10、15、20、25 min，消毒后用無(wú)菌水沖洗3～4次。

1.2.3接種。在超凈工作臺(tái)上將消毒過(guò)的外植體切成帶腋芽長(zhǎng)度為1～2 cm的莖段，將莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種30個(gè)帶芽莖段，重復(fù)3次。

1.2.4培養(yǎng)條件。 培養(yǎng)溫度為24～26 ℃，光照時(shí)間為10 h/d，光照強(qiáng)度為1 800～2 200 lx。

1.3統(tǒng)計(jì)方法培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)污染情況；培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)褐化死亡率和成活率。

污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

褐化死亡率=死亡褐化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

成活率=成活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

2　結(jié)果與分析

2.1乙醇與氯化汞不同時(shí)間配合處理對(duì)外植體的影響由表1可知，乙醇與氯化汞結(jié)合消毒對(duì)污染有一定的控制作用，但兩者結(jié)合消毒，可能破壞了莖段的生長(zhǎng)點(diǎn)，導(dǎo)致成活率不高。從污染率來(lái)看，隨著0.1%氯化汞消毒時(shí)間的增加，污染率逐漸降低。從死亡率來(lái)看，隨著消毒時(shí)間的增加，褐化死亡率也在逐漸增加。從成活率來(lái)看，75%乙醇和0.1%氯化汞作為消毒劑，隨著0.1%氯化汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率呈先上升，然后逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)0.1%氯化汞消毒時(shí)間超過(guò)12 min后，成活率為0；當(dāng) 0.1%氯化汞消毒時(shí)間為 10 min 時(shí)，成活率最高，但僅為 38.89%。因此，當(dāng)乙醇與氯化汞結(jié)合消毒時(shí)，變異冬紅果莖段較適宜的消毒方法為75%乙醇30 s+0.1%氯化汞10 min。

表1乙醇與氯化汞對(duì)變異冬紅果莖段的消毒效果

Table1DisinfectioneffectofalcoholandmercuricchloridsonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號(hào)GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate175%乙醇30s+0.1%氯化汞7min33.3344.4422.22275%乙醇30s+0.1%氯化汞8min22.2250.0027.78375%乙醇30s+0.1%氯化汞9min16.6752.2231.11475%乙醇30s+0.1%氯化汞10min5.5655.5638.89575%乙醇30s+0.1%氯化汞11min4.4473.3322.22675%乙醇30s+0.1%氯化汞12min3.3396.670775%乙醇30s+0.1%氯化汞15min0100.000

2.2氯化汞(0.1%)不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響由表2可知，從污染率來(lái)看，隨著0.1%氯化汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率逐漸降低。同時(shí)，從褐化死亡率來(lái)看，隨著消毒時(shí)間的增加，雖然污染率降低了，但死亡率在逐漸增加。從成活率來(lái)看，隨著0.1%氯化汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率呈先上升，然后逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)0.1%氯化汞消毒時(shí)間為 8 min 時(shí)，成活率最高，為50.00%，褐化死亡率為 20.00%。因此，用0.1%氯化汞消毒較為適合的消毒時(shí)間為8 min。

表2氯化汞(0.1%)對(duì)變異冬紅果莖段的消毒效果

Table2Disinfectioneffectof0.1%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號(hào)GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.1%氯化汞6min72.2211.1116.6720.1%氯化汞7min41.1116.6742.2230.1%氯化汞8min22.2220.0050.0040.1%氯化汞9min20.0038.8941.11

2.3氯化汞(0.05%)不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響由表3可知，降低氯化汞的濃度并延長(zhǎng)消毒時(shí)間，有效提高了變異冬紅果莖段的成活率。隨著0.05%氯化汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率顯著降低。從褐化死亡率來(lái)看，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化死亡率緩慢增長(zhǎng)。從成活率來(lái)看，隨著0.05%氯化汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，成活率整體較高，呈先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)0.05%氯化汞消毒時(shí)間為 20 min 時(shí)，成活率最高，可達(dá)71.11%，褐化死亡率為11.11%。因此，用0.05%氯化汞消毒較為適合的消毒時(shí)間為20 min。

表3氯化汞(0.05%)對(duì)變異冬紅果莖段的消毒效果

Table3Disinfectioneffectof0.05%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號(hào)GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.05%氯化汞10min66.674.4428.8920.05%氯化汞15min35.566.6757.7830.05%氯化汞20min17.7811.1171.1140.05%氯化汞25min11.1133.3355.56

3　結(jié)論與討論

通過(guò)以上研究可以發(fā)現(xiàn)，消毒劑和消毒時(shí)間的選擇對(duì)變異冬紅果莖段無(wú)菌體系的建立有很大的影響，通過(guò)3種消毒方式比較，結(jié)果表明最佳的消毒方式為0.05%氯化汞消毒20 min，污染率為17.78%，褐化死亡率為11.11%，成活率為71.11%；其次為0.1%氯化汞消毒8 min，污染率為22.22%，褐化死亡率為20.00%，成活率為50.00%；而75%乙醇30 s結(jié)合0.1%氯化汞10 min消毒，污染率為5.56%，褐化死亡率為55.56%，成活率為38.89%，效果最差。相比其他蘋果屬植物莖段的消毒處理，消毒方法和消毒時(shí)間仍有很大差異。垂絲海棠帶芽嫩莖適宜用75%乙醇(20～30 s)和0.3%氯化汞(2～3 min)結(jié)合消毒[10]；木瓜海棠帶芽嫩莖適宜用75%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(8～15 min)結(jié)合消毒[11]；來(lái)安花紅水培外植體莖段適宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化

汞(4 min)結(jié)合消毒，野外采集的外植體莖段適宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(7 min)結(jié)合消毒[12]；貼梗海棠帶芽嫩莖適合用75%乙醇(45 s)和0.1%氯化汞(8 min)結(jié)合消毒[13]，也有研究表明貼梗海棠莖段適合用0.1%氯化汞(7～15 min)消毒[14]。由此可知，短時(shí)間和低濃度的氯化汞消毒更適合變異冬紅果莖段，但氯化汞消毒時(shí)間過(guò)短，只能除去表面細(xì)菌，無(wú)法除去內(nèi)源菌，而氯化汞濃度過(guò)高或消毒時(shí)間太長(zhǎng)，則可能會(huì)對(duì)莖段組織細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使細(xì)胞活性降低，甚至死亡[15]。因此，針對(duì)不同的蘋果屬植物，需要篩選不同的消毒劑和消毒時(shí)間，從而比較出較適宜的消毒方法。

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