臍帶間充質(zhì)干細胞對輻射損傷小鼠造血功能的影響

顏賀欣，李偉，韋立順，宋永紅，單鐵英，高鵬，楊以會，喬俊紅

1.河北工程大學 醫(yī)學院，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學 附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002；3.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物安全處，北京 100071

伴隨科學技術(shù)的快速發(fā)展，日常生活里人們不可避免地要接觸放射性電離輻射，例如核作業(yè)人員、臨床上的放射性治療手段以及生活中的低劑量輻射。長期的電離輻射會對人體器官臟器的機能造成損傷，例如輻射后造血功能降低、器官組織形態(tài)改變、代謝功能改變，以及生物膜、酶活性和微循環(huán)的改變等[1]。目前，對放射性電離輻射的研究熱點是尋求有效的無副作用的治療手段和方法，探討放射性電離輻射產(chǎn)生的損傷。臍帶間充質(zhì)干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）是一類多功能干細胞，可從大部分結(jié)締組織和器官間質(zhì)中提取到。UCMSC有非常強大的功能，包括自我更新和自我復制的功能，多向分化潛能和在特定環(huán)境下定向分化增殖為各種組織和器官細胞的功能，免疫調(diào)節(jié)功能，具有分化度低、有絲分裂低、DNA分離不對稱等特征[2]。基于這些特性，UCMSC在輻射性損傷的治療中有很大進展，是用于輻射醫(yī)學治療的理想選擇。我們通過制作小鼠電離輻射損傷模型，觀察量化指標，探究UCMSC對輻射損傷小鼠造血功能的防護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級SD小鼠（雄性，8周齡，體重20±2 g）購自青島藥檢所動物中心，所有動物經(jīng)檢疫符合實驗動物標準，試驗期間在室溫18～22℃、濕度45%～65%的標準鼠房環(huán)境中統(tǒng)一飼養(yǎng)，整個試驗過程都嚴格遵循《實驗動物管理條例》。

UCMSC懸浮液來自清華大學深圳研究生院；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；PBS緩沖液購自武漢博士德生物工程有限公司；7200型全自動生化分析儀為日本島津公司產(chǎn)品；放射源為青島大學附屬醫(yī)院放療科直線加速器；UV757CRT型紫外分光光度計為上海精科公司產(chǎn)品；酶標儀為天津瑞澤公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物模型的建立

采用2 Gy劑量的醫(yī)用直線加速器對小鼠進行全身照射。

1.3 實驗動物分組

將80只雄性清潔級小鼠隨機平均分為4組，即正常組（不干預）、放射組（照射，不予治療）、普通組（照射后12 h尾靜脈注射UCMSC懸浮液）和加強組（照射后12和24 h，2次給予UCMSC懸浮液）。

1.4 外周血細胞測定

各階段采集血液標本前小鼠禁食12 h，次日腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，將其仰臥固定于手術(shù)臺上，碘伏消毒頸部至腹部皮膚，沿腹正中線剪開皮膚和腹膜，推移腸管暴露后腹膜，鈍性分開，剖開胸，經(jīng)心臟用一次性抗凝真空采血管于無菌條件下取血1～2 mL并混勻，2 h內(nèi)送血標本上機檢查血常規(guī)；取0.5 mL全血于自動血球分析儀進行細胞計數(shù)，剩余血樣室溫靜置40 min后4000 r/min離心10 min，取上層血清于凍存管中，-80℃冰箱保存。離心后所收集血清用來測定SOD活性和MDA含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示。組間比較用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠輻射損傷后白細胞數(shù)的變化

血常規(guī)結(jié)果顯示，小鼠輻射損傷后白細胞總數(shù)明顯下降，與正常組相比差別顯著（P＜0.05）；與對照組比較，注射UCMSC后普通組和加強組小鼠白細胞總數(shù)顯著增高，差別顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 各組小鼠輻射損傷后淋巴細胞數(shù)的變化

小鼠輻射損傷后淋巴細胞總數(shù)明顯下降，與正常組相比差別顯著（P＜0.05）；與對照組比較，注射UCMSC后普通組和加強組小鼠淋巴細胞總數(shù)顯著增高，差別顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 各組小鼠輻射損傷后紅細胞數(shù)的變化

小鼠輻射損傷后紅細胞總數(shù)明顯下降，與正常組相比差別顯著（P＜0.05)；與對照組比較，注射UCMSC后普通組和加強組小鼠紅細胞總數(shù)顯著增高，差別顯著（P＜0.05)。結(jié)果見表3。

2.4 各組小鼠輻射損傷后血紅蛋白數(shù)的變化

小鼠輻射損傷后血紅蛋白總數(shù)明顯下降，與正常組相比差別顯著（P＜0.05）；與對照組比較，注射UCMSC后普通組和加強組小鼠血紅蛋白總數(shù)顯著增高，差別顯著（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

2.5 輻射后小鼠血清SOD活性和MDA含量檢測

2.5.1 小鼠血清中的SOD活性 圖1顯示，放射組與正常組比較，血清SOD活性下降（P＜0.01）；普通組與放射組比較，血清SOD活性升高（P＜0.05）；加強組與普通組比較，SOD活性升高（P＜0.01）。

2.5.2 小鼠血清中的MDA含量 圖2顯示，放射組與正常組比較，血清MDA含量下降（P＜0.01）；普通組與放射組比較，血清MDA含量升高（P＜0.05）；加強組與普通組比較，血清MDA含量升高（P＜0.05）。

表1 不同組小鼠血常規(guī)檢測白細胞計數(shù)（x±s，1012/L）

表2 不同組小鼠血常規(guī)檢測淋巴細胞計數(shù)(x±s，109/L)

表3 不同組小鼠血常規(guī)檢測紅細胞計數(shù)（x±s，1012/L）

表4 不同組小鼠血常規(guī)檢測血紅蛋白計數(shù)（x±s，g/L）

3 討論

全身輻射性損傷損害機體的各個系統(tǒng)，其中造血系統(tǒng)對輻射的敏感性很高，所以對造血系統(tǒng)的危害非常嚴重。電離輻射會破壞造血微環(huán)境和造血細胞的增殖能力[3]，使機體的防御適應(yīng)能力下降，免疫功能降低，不能維持正常的生命活動，嚴重時會出現(xiàn)出血、感染、休克甚至死亡[4]。輻射后機體細胞內(nèi)產(chǎn)生自由基，它會破壞機體細胞的生物膜和核酸[5-6]。SOD具有超強的氧化作用，可以氧化自由基保護機體細胞，活性越高清除自由基的能力越強；MDA是氧化后降解的中間產(chǎn)物，對細胞有殺傷性，含量越低細胞損傷越小。機體受到電離輻射后，造血系統(tǒng)功能下降，外周血白細胞、紅細胞、淋巴細胞減少，導致機體貧血，易發(fā)生感染等并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為造血綜合征，同時出現(xiàn)細胞凋亡的現(xiàn)象[7-9]。因此，急需尋求有效的治療方法，解決由輻射引起的造血系統(tǒng)損傷這一難題。

圖1 輻射小鼠血清中SOD活性變化a：P＜0.01；b：P＜0.05；c：P＜0.01

圖2 輻射小鼠血清中MDA含量變化a：P＜0.05；b：P＜0.05；c：P＜0.01

目前針對放射性損傷的治療方法主要是藥物治療，例如抗生素、中草藥的有效成分[10]、細胞因子及激素類等。近幾年，具有獨特生物學特性的間充質(zhì)干細胞受到廣大研究者的青睞，間充質(zhì)干細胞在放射性損傷疾病的治療中也展現(xiàn)了優(yōu)勢，它具有多向分化為成體干細胞的能力，能分泌一些特殊細胞因子，具有歸巢到損傷的局部組織的能力。歸巢到受損組織局部的UCMSC，在刺激因子[4]的作用下分化為相應(yīng)組織細胞，促進損傷組織的再生和修復。它能分泌造血因子，重造造血環(huán)境，免疫原性低，在電離輻射損傷的臨床治療應(yīng)用中具有非常廣闊的前景。但間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)傳代過程中體積增大，定向歸巢到局部受損組織部位的數(shù)量很少，同時會出現(xiàn)堵塞血管的情況，影響治療的效果。本實驗采用的是經(jīng)過高遷徙間充值干細胞三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)傳代的細胞，比傳統(tǒng)培養(yǎng)細胞體積小70%，仍保持原有的特性和功能，避免出現(xiàn)上述問題[11]。

實驗結(jié)果表明，注射UCMSC懸浮液的小鼠外周血細胞數(shù)比放射組小鼠有所增加，說明UCMSC在一定程度上改善了輻射對小鼠造血功能的損傷。UCMSC可以提高輻射小鼠血清中SOD的活性并顯著降低血清中MDA的含量，說明UCMSC抑制了小鼠輻射性氧化損傷，對輻射引起的造血系統(tǒng)功能損傷有一定的防護作用。綜上所述，臍帶間充質(zhì)干細胞可以改善受損的造血微環(huán)境，顯示出良好的應(yīng)用前景，為放射性疾病的治療提供了新的途徑，值得進一步探討。

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