CXCL1促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肝癌腫瘤微環(huán)境中傳遞

彭雨蒙，陳偉，鄒嶺，葉甲舟，白濤，陳潔，陳健康，王翠，劉寧，楊曉莉，魏從文，鐘輝，吳飛翔，5

1.廣西醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 530021；2.湘南學(xué)院 附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000；3.中國人民武裝警察部隊(duì)總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100039；4.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850；5.廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530021

腫瘤細(xì)胞及其相關(guān)巨噬細(xì)胞等組成的腫瘤微環(huán)境與腫瘤從良性轉(zhuǎn)化為惡性密切相關(guān)，促進(jìn)腫瘤在沒有生長因子條件下的存活，調(diào)控細(xì)胞免疫促進(jìn)腫瘤自身的生長和轉(zhuǎn)移[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指腫瘤微環(huán)境中的各種因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白超負(fù)荷或折疊受阻，從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊的蛋白堆積[3]。ERS發(fā)生時(shí)，癌細(xì)胞常通過激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein reaction，UPR）3個(gè)相關(guān)信號通路IRE1、ATF6、PERK增加蛋白折疊，減少未折疊蛋白的合成，恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)錯誤折疊持續(xù)發(fā)生，誘導(dǎo)了持久且程度嚴(yán)重的ERS，UPR就會變成促進(jìn)凋亡的通路[4-5]。近年來的研究表明，ERS不僅可通過腫瘤細(xì)胞間的相互激活UPR通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對ERS的耐受，同時(shí)可通過與巨噬細(xì)胞間相互作用促進(jìn)腫瘤生長[6]。我們前期通過衣霉素（tunicamycin，TM）刺激人肝癌HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生ERS后，上清中趨化因子1（CXC chemokine ligand 1，CXCL1）的表達(dá)量顯著高于趨化因子家族的其他成員，但在ERS的條件下，CXCL1對于微環(huán)境中肝癌細(xì)胞及肝癌相關(guān)巨噬細(xì)胞的作用尚不明確。在本研究中，我們收集發(fā)生ERS的人肝癌HepG2細(xì)胞上清，作用于未發(fā)生ERS的HepG2細(xì)胞和分化成熟的巨噬細(xì)胞（THP-1），探究CXCL1在ERS條件下對肝癌微環(huán)境中肝癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1、HepG2細(xì)胞（軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程所鐘輝課題組惠贈）；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；轉(zhuǎn)染試劑VigoFect（Qbiogene公司）；衣霉素、丙二醇甲醚醋酸酯（TPA）、DMSO、人CXCL1 ELISA試劑盒（Sigma-Aldrich公司）；TRNzol-A+總RNA提取試劑盒、Su?perReal熒光定量預(yù)混試劑彩色版（SYBR Green）（天根生化科技有限公司）；TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒（全式金生物技術(shù)公司）；jetPRIMEin vitroDNA&siRNA transfec?tion reagent（Polyplus公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為200 U/mL的青、鏈霉素，當(dāng)細(xì)胞長至密度為5×107/皿時(shí)，用0.1%TPA分2次誘導(dǎo)48 h，使THP-1分化為成熟巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 建立ERS時(shí)肝癌微環(huán)境中細(xì)胞間傳遞模型

收集條件培養(yǎng)基建立不同細(xì)胞間ERS傳遞模型[6]。HepG2細(xì)胞長至70%時(shí)，換成含10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，分別按未處理、5 mmol/mL DMSO和5 mmol/mL TM處理細(xì)胞12 h后換成新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h收集培養(yǎng)基，離心后分別加入誘導(dǎo)成熟的THP-1和HepG2細(xì)胞中，分別培養(yǎng)12和24 h后收集細(xì)胞提取mRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測HepG2和THP-1細(xì)胞IRE1、PERK、ATF6的mRNA表達(dá)情況。

1.4 ELISA檢測培養(yǎng)基中的CXCL1含量

按照人CXCL1 ELISA試劑盒說明書檢測培養(yǎng)基中的CXCL1含量。收集TM刺激后的條件培養(yǎng)基，離心后分別與標(biāo)準(zhǔn)樣加入樣板中，室溫孵育1 h，洗板3次后，加入100 μL鏈霉親和素-HRP工作液，室溫孵育20 min，再次洗板3次后，TMB顯色，終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測，計(jì)算CXCL1的含量。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

TRIzol法提取各組細(xì)胞RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增引物見表1，以β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)條件：95℃ 15 min，95℃10 s，根據(jù)不同目的基因60～66℃延伸30 s。

1.6 敲低HepG2細(xì)胞中CXCL1表達(dá)

合成siRNA-CXCL1序列（正義鏈：5'-CACCC AAACCGAAGUCAUAGCCA-3'；反義鏈：5'-UGGC UAUGACUUCGGUUUGGGUG-3'）。當(dāng)HepG2細(xì)胞長至40%～50%時(shí)可用于轉(zhuǎn)染。將2 μg質(zhì)粒與100 μL生理鹽水混勻，靜置5 min，再將2 μL VigoFect與100 μL生理鹽水混勻，將以上兩者輕輕混合，室溫靜置15 min后加到培養(yǎng)基中；為提高敲低效率，于轉(zhuǎn)染24 h后按上述步驟再轉(zhuǎn)染一次；對照組轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒；48 h后收集培養(yǎng)液及細(xì)胞，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，ELISA檢測上清中CXCL1的表達(dá)情況。

1.7 收集CXCL1敲低的條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)HepG2和TPH-1細(xì)胞

當(dāng)CXCL1敲低的HepG2細(xì)胞長至70%時(shí)，換成含10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，再分未處理組、5 mmol/mL DMSO組、5 mmol/mL TM組，刺激12 h后換成新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h收集培養(yǎng)基，離心后分別加到誘導(dǎo)成熟的THP-1和HepG2細(xì)胞中，分別培養(yǎng)12和24 h后收集細(xì)胞提取mRNA，RT-PCR檢測HepG2和THP-1細(xì)胞IRE1、PERK、ATF6的mRNA表達(dá)情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析處理

計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建ERS在細(xì)胞間傳遞的模型

收集TM刺激HepG2細(xì)胞后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2和TPH-1細(xì)胞12和24 h后，熒光定量PCR檢測4組細(xì)胞中UPR相關(guān)IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平。結(jié)果提示，2種細(xì)胞中3種蛋白的mRNA水平均較空白對照和DMSO對照組升高（圖1、2）。

圖1 ERS條件培養(yǎng)基刺激人肝癌HepG2細(xì)胞后UPR相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

2.2 檢測si-CXCL1的敲低效率

轉(zhuǎn)染si-CXCL1敲低HepG2細(xì)胞的CXCL1水平，RT-PCR技術(shù)檢測敲低效率，ELISA檢測其培養(yǎng)基中分泌的CXCL1含量。結(jié)果顯示，與對照組相比，si-CXCL的敲低效率達(dá)67.89%（圖3），敲低后HepG2細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的CXCL1也明顯減少（P＜0.05）（圖4）。

圖2 ERS條件培養(yǎng)基刺激人巨噬細(xì)胞THP-1后UPR相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

圖3 RT-PCR檢測si-CXCL1對293T細(xì)胞中CXCL1的敲低效率

圖4 ELISA檢測si-CXCL1敲低293T細(xì)胞后培養(yǎng)基中CXCL1濃度

2.3 敲低CXCL1后對ERS在細(xì)胞間傳遞的影響

收集TM刺激后si-CXCL1的HepG2細(xì)胞的上清，離心后分別用于培養(yǎng)HepG2和TPH-1細(xì)胞，分別于12和24 h通過熒光定量PCR檢測4組細(xì)胞中UPR相關(guān)IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平。結(jié)果提示，HepG2和THP-1細(xì)胞中IRE1、PERK、ATF6的mRNA水平均較空白對照和DMSO對照組降低（圖5、6）。

圖5 CXCL1敲低的ERS條件培養(yǎng)基刺激人肝癌HepG2細(xì)胞后UPR相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)

圖6 CXCL1敲低的ERS條件培養(yǎng)基刺激人巨噬細(xì)胞THP-1后UPR相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)

3 討論

肝癌是在慢性乙型肝炎肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來的腫瘤，ERS貫穿肝癌發(fā)生發(fā)展的始終[7]。ERS在不同細(xì)胞之間的傳遞，一方面激活腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞中多種信號通路；另一方面激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥因子，影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-10]。為了探討細(xì)胞間的相互作用，我們首先收集了ERS時(shí)的條件培養(yǎng)基，建立了ERS時(shí)細(xì)胞間傳遞的模型，用于后續(xù)研究。

趨化因子是炎癥刺激下由腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它們一方面通過募集其他免疫細(xì)胞促進(jìn)腫瘤免疫，另一方面導(dǎo)致慢性炎癥并促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成并抑制細(xì)胞凋亡[11]。研究表明，CXCL1在包括肝癌在內(nèi)的大部分腫瘤中高表達(dá)，這種高表達(dá)與腫瘤預(yù)后較差密切相關(guān)。雖然在肝癌中CXCL1可通過CXCR2-CXCL1軸[12]和CXCL/NF-κB正反饋[13]調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，然而CXCL1在肝癌ERS中的作用研究較少。Lee等[14]通過Tg誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，CXCL1的表達(dá)增加，而腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞下調(diào)，提示CXCL1可能在ERS中介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用。本研究建立的細(xì)胞間傳遞模型，顯示在微環(huán)境中的ERS可通過CXCL1同時(shí)在腫瘤細(xì)胞間和腫瘤細(xì)胞與分化成熟的巨噬細(xì)胞間傳遞。

UPR是ERS發(fā)生后細(xì)胞為應(yīng)對壓力、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)做出的反應(yīng)。UPR通過激活細(xì)胞膜上的IRE1、ATF6、PERK促進(jìn)蛋白折疊，然而ATF6上調(diào)也可上調(diào)壞死因子CHOP蛋白的表達(dá),促進(jìn)腫瘤壞死[15]。在多數(shù)腫瘤中，UPR通路呈一條或多條激活狀態(tài)，UPR中不同通路的激活對腫瘤患者預(yù)后受益作用往往不同[16]。Kim等[17]研究肺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，GRP78和CHOP通路激活，患者總體生存降低；而Hetz等[18]通過基因組UPR靶基因指數(shù)系統(tǒng)研究雌激素受體α（ERα）陽性乳腺癌患者，發(fā)現(xiàn)UPR的3條通路均激活，且激活的UPR通路與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2和分化成熟的THP-1細(xì)胞時(shí)，UPR的3條通路表達(dá)均增加，且同Hetz等研究乳腺癌時(shí)UPR的3條通路均被激活導(dǎo)致患者不良預(yù)后類似。前期研究表明CXCL1的增加與肝癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，而當(dāng)下調(diào)HepG2細(xì)胞中的CXCL1表達(dá)后，UPR通路中的PERK、IRE、ATF6均較對照組降低，表明ERS可通過CXCL1在細(xì)胞間傳遞，介導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展。然而我們還注意到，THP-1細(xì)胞中的UPR蛋白與HepG2細(xì)胞中的UPR蛋白在CXCL1變化時(shí)二者的變化趨勢一致。通常來說包括CXCL1在內(nèi)的趨化因子表達(dá)升高可促進(jìn)巨噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的吞噬作用，本研究中，CXCL1增加時(shí)，ERS相關(guān)蛋白mRNA水平也增加，這種增加是否有助于促進(jìn)具有吞噬作用的M1型巨噬細(xì)胞向促進(jìn)腫瘤生長的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有待更多研究[8]。

本研究表明，肝癌腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間ERS可通過CXCL1進(jìn)行傳遞，這種細(xì)胞間傳遞作用可引起UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。

[1] Serafini P,Borrello I,Bronte V.Myeloid suppressor cells in cancer:recruitment,phenotype,properties, and mechanismsofimmunesuppression[J].Seminars Cancer Biol,2006,16(1):53-65.

[2] Grivennikov S I,Greten F R,Karin M.Immunity,in?flammation,and cancer[J].Cell,2010,140(6):883-899.

[3] Feldman D E,Chauhan V,Koong A C.The unfolded protein response:a novel component of the hypoxic stress response in tumors[J].Mol Cancer Res,2005,3 (11):597-605.

[4] Ron D,Walter P.Signal integration in the endoplas?mic reticulum unfolded protein response[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(7):519-529.

[5] Ma Y,Brewer J W,Diehl J A,et al.Two distinct stresssignaling pathwaysconverge upon the CHOP promoter during the mammalian unfolded protein re?sponse[J].J Mol Biol,2002,318(5):1351-1365.

[6] Mahadevan N R,Rodvold J,SepulvedaH,etal. Transmission of endoplasmic reticulum stress and proinflammation from tumor cells to myeloid cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(16):6561-6566.

[7] Sunami Y,Ringelhan M,Kokai E,et al.Canonical NF-kappaB signaling in hepatocytes acts as a tumorsuppressor in hepatitis B virus surface antigen-driven hepatocellularcarcinoma by controlling the unfolded protein response[J].Hepatology,2016,63(5):1592-1607.

[8] Oh J,Riek A E,Weng S,et al.Endoplasmic reticu?lum stress controls M2 macrophage differentiation and foam cellformation[J].J BiolChem,2012,287(15): 11629-11641.

[9] Bi M,Naczki C,Koritzinsky M,et al.ER stress-regu?lated translation increases tolerance to extreme hypox?ia and promotes tumor growth[J].EMBO J,2005,24 (19):3470-3481.

[10]Mahadevan N R,Zanetti M.Tumor stress inside out: cell-extrinsic effects of the unfolded protein response in tumor cells modulate the immunological landscape of the tumor microenvironment[J].J Immunol,2011,187 (9):4403-4409.

[11]Boissiere-Michot F,Lazennec G,Frugier H,et al. Characterization ofan adaptiveimmune responsein microsatellite-instable colorectal cancer[J].Oncoimmu?nology,2014,3:e29256.

[12]Li L,Xu L,Yan J,et al.CXCR2-CXCL1 axis is cor?related with neutrophil infiltration and predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2015,34:129.

[13]Cao Z,Fu B,Deng B,et al.Overexpression of Chemo?kine(C-X-C)ligand 1(CXCL1)associated with tumor progression and poor prognosis in hepatocellular carci?noma[J].Cancer Cell Int,2014,14(1):86.

[14]Lee B R,Chang S Y,Hong E H,et al.Elevated en?doplasmic reticulum stress reinforced immunosuppres?sion in the tumor microenvironment via myeloid-de? rived suppressor cells[J].Oncotarget,2014,5(23):12331-12345.

[15]Maurel M,McGrath E P,Mnich K,et al.Controlling the unfolded protein response-mediated life and death decisions in cancer[J].Seminars Cancer Bio,2015,33: 57-66.

[16]Galmiche A,Sauzay C,Chevet E,et al.Role of the unfolded protein response in tumor cell characteristics and cancer outcome[J].Curr Opin Oncol,2017,29(1): 41-47.

[17]Kim K M,Yu T K,Chu H H,et al.Expression of ER stress and autophagy-related molecules in human non-small cell lung cancer and premalignant lesions[J]. Int J Cancer,2012,131(4):E362-E370.

[18]Hetz C,Chevet E,Oakes S A.Proteostasis control by the unfolded protein response[J].Nat Cell Biol,2015, 17(7):829-838.