A型肉毒毒素單克隆抗體的制備和鑒定

呂孫慧，劉凌志，霍江，李磊，汪建華，游松，熊向華，張惟材

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京100071；3.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科，北京 100071；4.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是由肉毒梭菌（Clostridium botulinum）產(chǎn)生的一種毒性極強(qiáng)的蛋白類(lèi)神經(jīng)毒素，有A～F共7種血清型，其中引起人類(lèi)肉毒中毒的有A、B、E、F型，A型毒性最強(qiáng)且最為常見(jiàn)[1]。成熟的A型肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過(guò)一對(duì)二硫鍵連接而成，重鏈C端與神經(jīng)肌肉接頭處神經(jīng)細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，是理想的保護(hù)性抗原，重鏈N端則負(fù)責(zé)將輕鏈轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)細(xì)胞[2]；輕鏈?zhǔn)且蕾?lài)Zn2+的蛋白酶[3]，切割SNARE復(fù)合物中的SNAP25蛋白，使突觸小泡與細(xì)胞膜無(wú)法融合，從而導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)不能釋放到神經(jīng)肌肉接頭的細(xì)胞縫隙，引起肌肉麻痹[4]。

目前治療A型肉毒中毒沒(méi)有有效的小分子化學(xué)藥物，臨床上使用馬血清，但馬血清存在病毒污染、過(guò)敏反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)，以及制備成本高、生產(chǎn)期長(zhǎng)、穩(wěn)定性差等問(wèn)題。單克隆抗體是取代馬血清的更理想的臨床藥物，而現(xiàn)有研究結(jié)果表明單個(gè)抗體難以起到理想的中和效果，多個(gè)抗體聯(lián)用的效果遠(yuǎn)大于單個(gè)抗體效果的加和[5]。我們以A型肉毒毒素重鏈C端（heavy chain carboxy terminal of BoNT serotype A，BoNT/AHc）為抗原免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)得到3株親和力高、特異性強(qiáng)的單抗，為A型肉毒毒素的抗體藥物研發(fā)，以及建立快速有效的肉毒毒素檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞（陳薇研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（Sigma公司）；抗體分型試劑盒（北京博奧龍免疫技術(shù)公司）；Protein-G親和層析柱（GE公司）；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Thermo公司）；96孔酶標(biāo)板（NEST公司）；PVDF膜（Millipore公司）；SDS-PAGE樣品緩沖液（生工技術(shù)公司）。

1.2 小鼠免疫

選取雌性BALB/c小鼠（6～8周齡），將50 μg抗原BoNT-AHc與完全弗氏佐劑混勻，采用皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行首次免疫；第21 d以相同劑量的BoNT-AHc與不完全弗氏佐劑混勻，以相同注射方式進(jìn)行第2次免疫；第42 d不加佐劑，用相同劑量進(jìn)行腹腔注射完成第3次免疫；第56 d以500 μg采用腹腔注射進(jìn)行強(qiáng)化免疫；第59 d取脾臟進(jìn)行融合。

1.3 細(xì)胞融合

強(qiáng)化免疫后3 d，將小鼠斷頸處死，用75%酒精消毒，在無(wú)菌狀態(tài)下將分離脾細(xì)胞的和Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞按5∶1混合，采用PEG法[6]進(jìn)行細(xì)胞融合，用含20%小牛血清的HAT選擇培養(yǎng)液重懸細(xì)胞濃度為1×106/mL，每孔100 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 篩選陽(yáng)性克隆及克隆化培養(yǎng)

選用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)融合細(xì)胞，7～10 d后換成HT培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周后改用一般培養(yǎng)液。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞布滿(mǎn)孔底1/10面積時(shí)，即可用ELISA法檢測(cè)特異性抗體，篩選出所需雜交瘤細(xì)胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3 d換一半培養(yǎng)液。

采用有限稀釋法將陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，在克隆前1 d制備飼養(yǎng)細(xì)胞層。將篩選出的雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至3～10/mL，每孔100 μL加入提前制備的飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7 d開(kāi)始換液，以后每2～3 d換一次液，8～9 d可見(jiàn)細(xì)胞克隆形成，檢測(cè)細(xì)胞上清中抗體活性，將篩選出的陽(yáng)性克隆株移至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞上清的效價(jià)。

1.5 抗體制備

每只小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，2周后取1×106雜交瘤細(xì)胞腹腔注射，接種細(xì)胞10 d后收集腹水，經(jīng)飽和硫酸銨鹽析后用Protein-G親和層析柱純化。

1.6 抗體分型

取純化的抗體稀釋至1/1000，用抗體分型試劑盒鑒定鼠單抗亞類(lèi)。

1.7 抗體純度測(cè)定

采用SDS-PAGE測(cè)定抗體的純度，取5 μg單抗加入2 μL上樣緩沖液和5 μL 1 mol/L的DTT，室溫放置30 min后煮沸5 min，進(jìn)行膠濃度為12.5%的SDS-PAGE，掃描后用軟件Gelpro32分析計(jì)算抗體的純度。

1.8 抗體特異性結(jié)合鑒定

采用Western印跡。取5 μL BoNT/AHc抗原，進(jìn)行膠濃度為12.5%的SDS-PAGE，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入鼠單抗室溫孵育1 h，用PBST洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑，于化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影并記錄。

1.9 抗體親和力常數(shù)測(cè)定

采用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗原抗體結(jié)合的親和力常數(shù)。分別測(cè)定4個(gè)BoNT/AHc抗原濃度（20、10、5、2.5 μg/mL）與抗體的結(jié)合反應(yīng)曲線，抗體取12個(gè)濃度（80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1562、0.7812、0.039 μg/mL）。用SPSS軟件進(jìn)行曲線擬合后得出每個(gè)抗原濃度對(duì)應(yīng)的最大D450nm值的一半時(shí)抗體的濃度。采用趙巧林報(bào)道的方法[7]計(jì)算抗體1B1、1B2、1C6的親和力常數(shù)。

1.10 單抗與抗原識(shí)別位點(diǎn)分析

采用疊加ELISA法計(jì)算抗體兩兩之間的疊加率AI。1 μg/mL的BoNT/AHc抗原于96孔酶標(biāo)板中4℃包被過(guò)夜，陰性對(duì)照孔包被1 μg/mL牛血清白蛋白（BSA），空白對(duì)照孔不包被底物。用5%脫脂奶粉于37℃封閉2 h，加入單抗1，37℃孵育1 h，加入單抗2，37℃孵育1 h，PBST洗5次后加入稀釋至1/2000的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h，PBST洗5次后加入TMB顯色液顯色10 min，每孔加50 μL 2 mol/L的濃硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值。用下式計(jì)算疊加率AI：

式中D1、D2、D1，2分別為單抗1、單抗2、單抗1疊加單抗2的D450nm值。若AI大于40%，即可認(rèn)為這2株單抗識(shí)別位點(diǎn)不同；若AI小于40%，則可認(rèn)為這2株單抗識(shí)別位點(diǎn)相同或相近。

2 結(jié)果

2.1 單克隆抗體篩選

BALB/c小鼠經(jīng)免疫后，取脾細(xì)胞和Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行2次克隆化，得到3株穩(wěn)定表達(dá)抗體的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株1B1、1B2、1C6，培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1.2×105、4.1× 106和1.2×105。

2.2 抗體的制備

篩選到的3株陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株1B1、1B2、1C6經(jīng)培養(yǎng)后注射到小鼠腹腔中制備腹水，通過(guò)硫酸銨鹽析和Protein-G親和層析純化，純化抗體經(jīng)SDS-PAGE后采用Gelpro32軟件計(jì)算純度，分別為93.6%、98.4%、94.2%。

2.3 抗體分型

取純化后的抗體稀釋至1/1000，用試劑盒進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果表明3株抗體重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ型，是鼠源抗體重鏈和輕鏈最為常見(jiàn)的亞型。

2.4 抗體特異性結(jié)合鑒定

以BoNT/AHc為抗原，抗體1B1、1B2、1C6為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western印跡，結(jié)果顯示單抗1B1、1B2、1C6與BoNT/AHc抗原均有特異性結(jié)合，表明3株抗體與抗原結(jié)合表位均為線性表位。

2.5 抗體親和力常數(shù)

通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定4個(gè)濃度的BoNTAHc抗原與抗體的結(jié)合反應(yīng)曲線，經(jīng)SPSS軟件擬合后計(jì)算出1B1、1B2、1C6的親和力常數(shù)分別為1.43×108、2.31×108和1.44×109L/mol。3株抗體與抗原結(jié)合的親和力常數(shù)均高達(dá)108L/mol以上，可見(jiàn)3株抗體與抗原都有很強(qiáng)的結(jié)合能力。

2.6 單抗與抗原識(shí)別位點(diǎn)分析

采用疊加ELISA法計(jì)算抗體兩兩之間的疊加率AI，結(jié)果顯示3株抗體兩兩配對(duì)的AI值均小于40%，說(shuō)明這3株單抗識(shí)別的位點(diǎn)相同或相近。

圖1 SDS-PAGE分析抗體純度M：蛋白marker；1：純化后的抗體1B1；2：純化后的抗體1B2；3：純化后的抗體1C6

圖2 Western印跡檢測(cè)鼠單抗與BoNT/AHc的特異性結(jié)合

表1 3株鼠單抗抗體分組結(jié)果

3 討論

相對(duì)全長(zhǎng)肉毒毒素而言，BoNT/AHc是肉毒毒素與受體結(jié)合的區(qū)域，免疫動(dòng)物后可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，且沒(méi)有輕鏈的內(nèi)切酶活性帶來(lái)的毒性，是更理想的保護(hù)性抗原。文獻(xiàn)報(bào)道也顯示以BoNT/AHc作為抗原免疫小鼠獲得具有中和活性的抗體的可能性高于以類(lèi)毒素作為抗原的傳統(tǒng)方法[8]。通過(guò)雜交瘤技術(shù)得到的鼠源單克隆抗體親和力高、特異性強(qiáng)、性質(zhì)均一、易于大量生產(chǎn)，在醫(yī)學(xué)實(shí)踐及生命科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。因而本次研究采用BoNT/AHc為抗原，通過(guò)雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備抗體，最終獲得了親和力高、特異性強(qiáng)的3株鼠單抗。后續(xù)研究一方面將測(cè)定3株抗體的中和活性以探討其成為A型肉毒中毒治療藥物的可能性，另一方面嘗試建立基于這3株抗體的A型肉毒毒素檢測(cè)方法（夾心ELISA或膠體金等）。

本研究得到的3株抗體與抗原結(jié)合表位相同或相近，而之前實(shí)驗(yàn)室制備得到的4株抗BoNT/ AHc單抗與抗原也有相同或相近的結(jié)合表位[9]，Onda等報(bào)道同樣顯示其篩選得到針對(duì)PE的60株鼠單抗抗原識(shí)別位點(diǎn)僅分布在7個(gè)表位組中[10]，由此可見(jiàn)通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備鼠單抗時(shí)存在抗原優(yōu)勢(shì)表位。若其優(yōu)勢(shì)表位同時(shí)也是抗原與受體結(jié)合的關(guān)鍵表位，則有利于中和抗體制備；若優(yōu)勢(shì)表位和抗原與受體結(jié)合的關(guān)鍵表位不一致，則會(huì)加大中和抗體的篩選難度。如果是前者，可以考慮將篩選得到的針對(duì)不同表位的中和抗體聯(lián)合使用以增強(qiáng)中和活性。Hayashi等研究表明，將BoNT/AHc作為抗原得到的針對(duì)不同表位的3株單抗聯(lián)用，抗體效價(jià)能達(dá)到傳統(tǒng)抗血清的500倍[11]，可見(jiàn)抗體聯(lián)用可以很好地增強(qiáng)中和活性。

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