春小麥品種川育19抗葉銹性遺傳分析

袁軍海，沈鳳英，吳偉剛，張愛香(河北北方學(xué)院 植物保護(hù)系，河北 宣化 075131)

葉銹病是我國小麥的重要病害，主要發(fā)生在小麥生長的中后期，因夏孢子堆的出現(xiàn)造成發(fā)病部位水分過度散失，最終導(dǎo)致小麥減產(chǎn)甚至死亡。小麥葉銹病的主要防治措施有種植抗病品種和噴灑化學(xué)藥劑。其中，種植抗病品種經(jīng)濟(jì)、有效、簡(jiǎn)便且對(duì)環(huán)境安全，更易被種植者采用?；诿系聽栠z傳規(guī)律的經(jīng)典遺傳分析，可以明確抗病基因的顯隱性、對(duì)數(shù)和相互作用關(guān)系等，一直是培育抗病品種的理論基礎(chǔ)，但由于該分析一般需要3～4 a的時(shí)間，所以更適宜對(duì)重要材料進(jìn)行深入研究。我國關(guān)于小麥抗葉銹病遺傳分析方面的研究始于20世紀(jì)90年代[1]，到目前為止，用于篩選分子標(biāo)記的相關(guān)研究較多[2-3]，而真正較為深入的、傳統(tǒng)意義上的遺傳分析仍然很少[4]，難以對(duì)抗病育種形成系統(tǒng)的理論指導(dǎo)。川育19由中國科學(xué)院成都生物研究所選育，區(qū)試代號(hào)為46648-1，系譜為川育5號(hào)/墨460//綿陽26,屬春性、早熟品種，綜合農(nóng)藝性狀較好[5-6]。2003—2009年，分別在北京冬麥區(qū)接種優(yōu)勢(shì)致病類型、在張家口春麥區(qū)自然發(fā)病，多次進(jìn)行抗病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該品種對(duì)葉銹病一直表現(xiàn)為慢病。通過基因推導(dǎo)認(rèn)為，川育19含有Lr1、Lr3和其他未知基因[7]。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，結(jié)合等位性驗(yàn)證，分別在苗期和成株期進(jìn)行抗病性測(cè)定，對(duì)川育19的抗葉銹性進(jìn)行了遺傳分析，以期為小麥抗葉銹病育種提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

小麥品種川育19最初由中國科學(xué)院成都生物研究所提供，小麥抗葉銹病近等基因系Lr1和Lr3的載體品系Tc*6/Centenario和Tc*6/Democrat最初由國際小麥玉米改良中心(CIMMYT)提供，感病對(duì)照品種為Thatcher；小麥葉銹病菌致病類型BGD/HL、FBC/GN、PHT/RP、SHJ/GL、THT/TP，從采自我國不同地區(qū)的小麥葉銹病標(biāo)樣中分離鑒定而來，按照Long等[8]和Singh[9]提出的密碼規(guī)則命名。上述材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所麥病組繁殖、保存并提供。

1.2　試驗(yàn)方法

配制了Thatcher×川育19、Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19和Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19共3個(gè)雜交組合。獲得F1代種子后，隨機(jī)選取6～8粒播種，花期套袋自交，6～8株所獲得的種子混合即為F2群體，再從中隨機(jī)選取180粒種子播種，每粒種子的后代作為1個(gè)F3株系。

苗期抗病性測(cè)定在小型塑料盒內(nèi)進(jìn)行，預(yù)先放入營養(yǎng)土，種子穴播，穴深1 cm、穴距5 cm，每穴5～7粒種子。雜交親本川育19、Tc*6/Centenario(Lr1)、Tc*6/Democrat(Lr3)和Thatcher分別播種5～7粒種子，各雜交組合的F1和F2分別播種8粒和600粒種子，F(xiàn)3播種150個(gè)株系，每個(gè)株系約70粒種子。當(dāng)小麥第一葉片充分展開時(shí)，先用清水去蠟，然后噴灑含0.05%吐溫20的夏孢子粉懸浮液，放入保濕桶內(nèi)，在室溫、黑暗條件下保濕約16 h，然后置于RXZ-280B型人工氣候箱(寧波江南儀器廠生產(chǎn))中培養(yǎng)，條件為：溫度18 ℃、相對(duì)濕度95%以上、光照強(qiáng)度12 000 lx，每天光照14 h。10～12 d后，當(dāng)感病對(duì)照充分發(fā)病時(shí)，按照Roelfs[10]確定的侵染型標(biāo)準(zhǔn)，劃分為0、；、1、2、X、3、4等7個(gè)級(jí)別調(diào)查；若同時(shí)出現(xiàn)2種侵染型，則多者列前少者列后，如“;1”表示以“;”為主，還有少量“1”，根據(jù)前者判斷抗病或感病類型；X表示同時(shí)出現(xiàn)“；”、“1”、“2”、“3”和“4”等侵染型中的3個(gè)或3個(gè)以上類型。將7個(gè)級(jí)別轉(zhuǎn)換為抗感反應(yīng)，具體為0—免疫、；—近免疫、1—高度抗病、2和X—中度抗病、3—中度感病、4—高度感病，遺傳分析時(shí) 0～X歸為抗病類型，3～4歸為感病類型。由于工作量較大，F(xiàn)3僅判斷整個(gè)株系屬全部抗病、抗感分離或全部感病，未做單株調(diào)查。

成株期抗病性測(cè)定在河北北方學(xué)院南校區(qū)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。小區(qū)寬2.2 m、長11 m，行距0.333 3 m，即每小區(qū)34行，兩端為保護(hù)行，中間每隔10行設(shè)1行誘發(fā)行，其余30行為鑒定行。各鑒定行橫向分為3部分：左、右各1 m播種待鑒定材料，中間留出約0.2 m空間，與各鑒定行垂直方向，縱向播種1行誘發(fā)行。保護(hù)行和誘發(fā)行品種均為Thatcher。雜交親本均條播1行，行長1 m；各雜交組合播種量同苗期，但F1和F2均點(diǎn)播，株距10 cm，F(xiàn)3條播，每個(gè)株系行長1 m。小麥返青后拔節(jié)前，選擇晴天無風(fēng)的傍晚，用致病類型PHT/RP和THT/TP的等比混合菌種接種。先在植株基部澆水至土壤含水量過飽和，然后將葉片用清水去蠟、噴灑含0.05%吐溫20的夏孢子粉懸浮液，最后蓋塑料膜保濕，次日日出前揭膜。管理同一般大田。待感病對(duì)照品種充分發(fā)病后，調(diào)查各植株旗葉的抗感反應(yīng)和嚴(yán)重度?？垢蟹磻?yīng)根據(jù)Roelfs[10]確定的侵染型標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查后轉(zhuǎn)換為抗感反應(yīng)類型；嚴(yán)重度根據(jù)Peterson等[11]確定的方法估測(cè)，記為0～100%。

2　結(jié)果與分析

2.1　供試小麥品種(系)抗葉銹性測(cè)定

川育19在苗期對(duì)PHT/RP和THT/TP表現(xiàn)高度感病，對(duì)其他供試致病類型均表現(xiàn)免疫，在成株期表現(xiàn)感病，但嚴(yán)重度僅為5%～10%。在苗期，Lr1的載體品系Tc*6/Centenario對(duì)致病類型BGD/HL和FBC/GN，及Lr3的載體品系Tc*6/Democrat對(duì)BGD/HL和SHJ/GL，均表現(xiàn)為近免疫，其他組合均表現(xiàn)為高度感病；二者在成株期均表現(xiàn)為高度感病。Thatcher在苗期和成株期均表現(xiàn)為高度感病(表1)。

表1　供試小麥品種(系)抗葉銹性測(cè)定結(jié)果

2.2　川育19苗期抗葉銹病遺傳分析

對(duì)Thatcher×川育19雜交組合接種致病類型BGD/HL，8株F1均表現(xiàn)抗病，F(xiàn)2共測(cè)定523株，484株歸為抗病類型、39株歸為感病類型，符合15(抗病)∶1(感病)的期望比例，說明川育19對(duì)致病類型BGD/HL的抗病性由2對(duì)獨(dú)立遺傳的顯性抗葉銹病基因控制；F3共測(cè)定150個(gè)株系，其中58個(gè)株系全部抗病、80個(gè)株系抗感分離、12個(gè)株系全部感病，符合7(全部抗病)∶8(抗感分離)∶1(全部感病)的期望比例，可驗(yàn)證F2的結(jié)果(表2)。對(duì)Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合接種致病類型BGD/HL，F(xiàn)2共測(cè)定517株，全部抗病，說明川育19含有Lr1，或群體尚小未出現(xiàn)感病植株。若為后者，則Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合至少含有4對(duì)獨(dú)立遺傳的顯性抗葉銹病基因，才能滿足517(抗病)∶0(感病)的分離情況，即川育19中至少含有3對(duì)顯性抗葉銹病基因，但這與相同情況下Thatcher×川育19雜交組合的分離情況不符合，故否定此可能性，認(rèn)為川育19含有Lr1。同理可推斷川育19亦含有Lr3。綜合判斷，在Thatcher×川育19雜交組合中，控制對(duì)致病類型BGD/HL抗病性的2對(duì)顯性抗葉銹病基因是川育19所含有的Lr1和Lr3。

對(duì)Thatcher×川育19雜交組合接種致病類型FBC/GN，6株F1均抗病，F(xiàn)2的分離符合3(抗病)∶1(感病)的期望比例，說明川育19對(duì)FBC/GN的抗病性由1對(duì)顯性抗葉銹病基因控制，F(xiàn)3的分離情況可驗(yàn)證上述結(jié)果(表2)。相同情況下對(duì)于Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合，538株F2全部抗病，同上述分析，可認(rèn)為川育19含有Lr1。即在Thatcher×川育19雜交組合中，控制對(duì)致病類型FBC/GN抗病性的1對(duì)顯性抗葉銹病基因是Lr1。相同條件下，Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19雜交組合的F2符合3(抗病)∶1(感病)的分離比例，考慮到FBC/GN對(duì)Lr3有毒性而對(duì)Lr1無毒性(表1)，故起作用的1對(duì)顯性抗葉銹病基因是川育19所含有的Lr1，否則，若川育19含有其他對(duì)FBC/GN有抗病作用的基因，則與相同情況下Thatcher×川育19雜交組合的分離情況無法相互驗(yàn)證。同理可推斷，在Thatcher×川育19和Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合中，控制對(duì)致病類型SHJ/GL抗病性的1對(duì)顯性抗葉銹病基因均為川育19所含有的Lr3。

表2　川育19苗期抗葉銹病遺傳分析

2.3　川育19成株期抗葉銹病遺傳分析

對(duì)Thatcher×川育19雜交組合，6株F1均表現(xiàn)為中度抗病，且嚴(yán)重度均低于30%；F2共測(cè)定557株，其中65株中度抗病、228株中度感病至感病，且嚴(yán)重度均低于30%，可歸為抗病類型，20株中度感病至感病，且嚴(yán)重度為31%～60%，考慮到在生產(chǎn)上尚有一定應(yīng)用價(jià)值，也歸為抗病類型，其余188株中度感病至感病及56株感病，且嚴(yán)重度均高于60%，可歸為感病類型，313株抗病、244株感病，符合9(抗病)∶7(感病)的期望比例，說明在Thatcher×川育19雜交組合中，成株期的抗病性由2對(duì)互補(bǔ)遺傳的顯性抗葉銹病基因控制；根據(jù)上述F2的抗病與感病的分界線判斷，F(xiàn)3有13個(gè)株系全部抗病、77個(gè)株系抗感分離、60個(gè)株系全部感病，符合1(全部抗病)∶8(抗感分離)∶7(全部感病)的期望比例，可驗(yàn)證F2的結(jié)果(表3)。

表3　川育19成株期抗葉銹病遺傳分析

注：S.感??；MS-S.中度感病至感病。

對(duì)Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合，5株F1均表現(xiàn)為中度抗病，除1株嚴(yán)重度為31%～60%外，其余4株均低于30%；根據(jù)上述分析確定的F2的抗感分界線判斷，F(xiàn)2有317株抗病、225株感病，符合9(抗病)∶7(感病)的期望比例；F3有5個(gè)株系全部抗病、75個(gè)株系抗感分離、70個(gè)株系全部感病，也符合1(全部抗病)∶8(抗感分離)∶7(全部感病)的期望比例。說明Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合在成株期的抗病性亦由2對(duì)互補(bǔ)遺傳的顯性抗葉銹病基因控制，與Thatcher×川育19雜交組合相同，同時(shí)也說明在Tc*6/Centenario(Lr1)×川育19雜交組合中，抗病性由川育19提供，Tc*6/Centenario(Lr1)的抗病性在成株期不起作用，可驗(yàn)證表1結(jié)果。同理，Tc*6/Democrat(Lr3)×川育19雜交組合在成株期的抗病性也由川育19提供的2對(duì)互補(bǔ)遺傳的顯性抗葉銹病基因控制，Tc*6/Democrat(Lr3)的抗病性在成株期亦不起作用。

3　結(jié)論與討論

川育19含有呈顯性遺傳的Lr1和Lr3，在苗期分別控制對(duì)致病類型FBC/GN和SHJ/GL的抗病性，且2對(duì)基因相互獨(dú)立遺傳，均控制對(duì)致病類型BDG/HL的抗病性；Lr1和Lr3的抗病性在成株期不起作用，川育19的成株期抗病性由2對(duì)互補(bǔ)遺傳的顯性抗葉銹病基因控制。

Lr1和Lr3在我國小麥品種中的出現(xiàn)頻率分別約為13.42%和9.17%[12]。由于較早的、廣泛性的應(yīng)用，導(dǎo)致病原物中相應(yīng)的毒性基因頻率上升，反過來克服抗病基因的抗病性，故Lr1和Lr3在我國早已經(jīng)失效。我國首次正式報(bào)道小麥葉銹菌群體毒性時(shí)，Lr1和Lr3的毒性頻率已分別達(dá)到30.02%和89.10%[13]，而在近期的許多報(bào)道中，二者均已達(dá)95%以上[14-15]。美國的情況也很相似[16]。但與合適的基因組合起來，Lr1和Lr3尚可發(fā)揮“殘存”的抗病性，提高整體抗病能力。如Lr1和Lr34在成株期的抗病性分別為90S和T-20M(T表示微量侵染型，M表示混合侵染型，分別與本研究中的近免疫侵染型“；”和中度抗病侵染型“X”近似)，將二者組合在同一品系中抗病性為T-5M[17]；Lr1、Lr3和Lr13在成株期的抗病性分別為80S、70S和60MR(MR表示中度抗病)，而Lr1和Lr13組合起來的抗病性為20MR-30MS，Lr3和Lr13組合起來的抗病性為10MR[18]。

在已正式命名的抗葉銹病基因中，僅Lr27和Lr31呈顯性遺傳且互補(bǔ)起作用[19-20]。陳萬權(quán)等[21]用我國葉銹菌優(yōu)勢(shì)致病類型測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Lr27+Lr31在成株期出現(xiàn)0(免疫)和65S 2種情況，懷疑是種子混雜所致，但在許多關(guān)于小麥葉銹菌群體毒性分析中，Lr27+Lr31的毒性頻率均在60%以上[15,21-22]，故65S的鑒定結(jié)果更可信，說明Lr27+Lr31的抗病性在我國已基本失效。而川育19在成株期的表現(xiàn)為5～10S，僅后期出現(xiàn)少量感病孢子堆，前期接近免疫，說明其抗病性仍比較有效。當(dāng)然，也可能出現(xiàn)Lr27+Lr31與Lr13或Lr34等基因互作提高抗病性的情況，但若如此，川育19在成株期的抗病性應(yīng)呈現(xiàn)3對(duì)及3對(duì)以上抗病基因分離的情況。所以，川育19中控制成株期抗病性的2對(duì)互補(bǔ)遺傳的顯性抗葉銹病基因更可能是新基因。

抗感分界線的劃分是遺傳分析的關(guān)鍵之一。本試驗(yàn)的苗期結(jié)果，明顯分為2部分，分別與抗病親本和感病親本的侵染型接近，沒有中間類型，或中間類型很少，且考慮到所有可能的期望比例后，劃歸抗病類型或感病類型均對(duì)最終結(jié)果無影響，直接根據(jù)F2即可判斷抗感分界線。但成株期的結(jié)果，中間類型較多，如果仍僅根據(jù)F2判斷，可能存在多個(gè)抗感分界線，能夠分別符合各自的期望比例。對(duì)此，楊作民[23]認(rèn)為，根據(jù)F3系統(tǒng)的不同分離情況反過來劃分F2單株類別，才是較合理的做法，這也是本試驗(yàn)進(jìn)行抗感分界線劃分時(shí)遵循的基本原則。

致謝：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的劉太國研究員和馮晶副研究員參與部分工作，謹(jǐn)此致謝！

參考文獻(xiàn):

[1]赤國彤，王煥如，朱之堉.7個(gè)小麥品種抗葉銹病遺傳研究初報(bào)[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，14(4)：76-78.

[2]王佳真，李在峰，李星，等.小麥品系5R618抗葉銹病基因的初步定位[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15(6)：1348-1351.

[3]張培培，周悅，董海焦，等.周麥11、西農(nóng)1163-4抗葉銹病基因與周8425B中LrZH84的關(guān)系[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(10)：33-36.

[4]袁軍海，陳萬權(quán).春小麥品種青春221抗葉銹性遺傳分析[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2013，40(1)：20-26.

[5]劉正德，姚革，蔣濱，等.四川省小麥條銹病、白粉病、赤霉病抗性鑒定及抗原篩選[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18(3)：291-294.

[6]伍玲，朱華忠，鄧麗，等.1997—2007年通過四川省區(qū)試審定的小麥品種述評(píng)[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21(3)：562-569.

[7]袁軍海，劉太國，陳萬權(quán).中國47個(gè)小麥新品種(系)苗期抗葉銹病基因推導(dǎo)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(9)：1925-1935.

[8]Long D L,Kolmer J A.A North American system of nomenclature forPucciniareconditaf.sp.tritici[J].Phytopathology,1989,79(5):525-529.

[9]Singh R P.Pathogenicity variations ofPucciniareconditaf.sp.triticiandP.graminisf.sp.triticiin wheat-growing areas of Mexico during 1988 and 1989[J].Plant Disease,1991,75(7):790-794.

[10]Roelfs A P.Race specificity and methods of study[M]//Bushnell W R,Roelfs A P.The cereal rust Ⅰ.Origins,specificity,structure,and physiology.New York:Academic Press,1985:134.

[11]Peterson R F,Campbell A B,Hannah A E.A diagrammatic scale for estimating rust intensity on leaves and stems of cereals[J].Canadian Journal of Research (Section C),1948,26(4):496-500.

[12]袁軍海，陳萬權(quán).中國小麥主要抗葉銹病基因的有效性評(píng)價(jià)[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2011，35(7)：794-801.

[13]郭愛國，赤國彤，楊文香，等.1990年河北省小麥葉銹菌群體的毒性分析[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，15(1)：43-46.

[14]趙盼盼，孟慶芳，郭楠，等.2009—2011年河南省小麥葉銹菌毒性結(jié)構(gòu)分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42(4)：91-94.

[15]原宗英，武英鵬，劉敏捷.山西省小麥葉銹菌致病類型及毒性監(jiān)測(cè)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2017，45(3)：448-450.

[16]Kolmer J A,Hughes M E.Physiologic specialization ofPucciniatriticinaon wheat in the United States in 2013[J].Plant Disease,2015,99(10):1261-1267.

[17]German S E,Kolmer J A.Effect of geneLr34 in the enhancement of resistance to leaf rust of wheat[J].Theoretical and Applied Genetics,1992,84(1):97-105.

[18]Kolmer J A.Enhanced leaf rust resistance in wheat conditioned by resistance gene pairs withLr13[J].Euphytica,1992,61(1):123-130.

[19]Singh R P,McIntosh R A.Complementary genes for reaction toPucciniareconditatriticiinTriticumaestivum.Ⅰ.Genetic and linkage studies[J].Canadian Journal of Genetics and Cytology,1984,26(6):723-735.

[20]Singh R P,McIntosh R A.Complementary genes for reaction toPucciniareconditatriticiinTriticumaestivum.Ⅱ.Cytogenetic studies[J].Canadian Journal of Genetics and Cytology,1984,26(6):736-742.

[21]陳萬權(quán)，秦慶明.國際上已知小麥抗葉銹病基因在中國的可利用性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35(7)：794-801.

[22]Liu T G,Chen W Q.Race and virulence dynamics ofPucciniatriticinain China during 2000—2006[J].Plant Disease,2012,96(11):1601-1607.

[23]楊作民.小麥對(duì)條銹病抗性遺傳的研究[J].作物學(xué)報(bào)，1981，7(2)：81-90.