膠紅酵母J6發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其生長曲線的繪制

劉　影，謝為天，徐春厚，張少敏，劉金帝(廣東海洋大學 農學院，廣東 湛江 524088)

海洋紅酵母是指存在于海洋環(huán)境及海洋生物中的單細胞真核微生物。研究表明，在南極、北極、印度海岸、深?；鹕郊笆芪廴竞Ｓ虻炔煌暮Ｑ蟓h(huán)境中，紅酵母均為優(yōu)勢菌群[1-5]。海洋紅酵母富含蛋白質、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、消化酶、維生素等多種生物活性物質，具有較高的營養(yǎng)價值和活性作用，可作為食品添加劑、功能生物飼料、抗氧化劑、生物催化劑、著色劑及微生物拮抗劑等應用[6-9]。

目前，有關海洋紅酵母作為益生菌及微生態(tài)制劑方面的研究與應用報道主要集中于水產養(yǎng)殖及水產動物飼料上[8]。海洋紅酵母微生態(tài)制劑能顯著提高水產動物幼苗的存活率、提高飼料效果和飼料報酬，并能增強動物體的免疫功能、減少抗生素用量，是生態(tài)養(yǎng)殖的優(yōu)良添加劑[10]。攝食添加海洋紅酵母飼料的水產動物具有抗病能力強、存活率高、皮膚和肌肉色澤鮮艷等優(yōu)點[11]。海洋紅酵母亦是微生物發(fā)酵生產類胡蘿卜素常用的菌種，具有生長周期短、天然無毒、生產成本較低的特點[12]。在海洋紅酵母中，膠紅酵母是南海近岸海域的優(yōu)勢種群[6-7]，其含有類胡蘿卜素、蝦青素、消化酶、維生素等活性物質[7]，是值得開發(fā)利用的益生菌株。鑒于此，選用從雷州半島近岸海域分離篩選的1株膠紅酵母J6，優(yōu)化其培養(yǎng)基成分，繪制其生長曲線，以期為該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　菌種

膠紅酵母J6由廣東海洋大學預防獸醫(yī)學實驗室分離鑒定、篩選和保存。

1.2　培養(yǎng)基

1.2.1紅酵母液體培養(yǎng)基2%蛋白胨、1%酵母膏、2%葡萄糖、2%NaCl，自然pH值。

1.2.2紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基2%蛋白胨、1%酵母膏、2%葡萄糖、2%NaCl、0.05% MgSO4，自然pH值。

1.3　膠紅酵母種子液的制備

將膠紅酵母J6斜面保存菌種接種于紅酵母液體培養(yǎng)基，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳2代，第2代培養(yǎng)物即為膠紅酵母種子液。

1.4　膠紅酵母培養(yǎng)物的制備

將膠紅酵母種子液按5%接種于紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為膠紅酵母培養(yǎng)物。

1.5　培養(yǎng)基優(yōu)化試驗

1.5.1單因素試驗

1.5.1.1碳源優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用2%蔗糖、2%海藻糖、2%麥芽糖代替，其他成分不變，按5%的接種量接種膠紅酵母種子液，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為單因素試驗的培養(yǎng)物。用培養(yǎng)物中的菌體細胞干質量(生物量)為判定標準篩選出適宜的碳源。

1.5.1.2氮源優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨和酵母膏分別用3%酵母膏、3%牛肉膏、1.5%蛋白胨+1.5%酵母膏、1%蛋白胨+1%酵母膏+1%牛肉膏代替，碳源為2%海藻糖，其他成分不變，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標準同上。

1.5.1.3無機鹽優(yōu)化將紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中的0.05% MgSO4分別用0.05% MnSO4、0.05% K2HPO4、0.025% MgSO4+0.025% K2HPO4代替，碳源為2%海藻糖，NaCl以及其他成分不變，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標準同上。

1.5.1.4氮源比例優(yōu)化根據(jù)優(yōu)化結果，固定碳源、氮源、無機鹽及NaCl的含量不變，用蛋白胨、酵母膏和牛肉膏按2∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2的比例配制成5種氮源組合，種子液接種量、培養(yǎng)條件和判定標準同上。

1.5.2正交試驗根據(jù)單因素試驗優(yōu)化出的碳源、氮源、無機鹽及氮源比例，采用6個因素、3個水平，共27個組別，每個組別做3次平行試驗，即使用L27(36)正交設計表，各個水平設計見表1。按5%的接種量將膠紅酵母種子液分別接種于27個組別的正交試驗發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，即為正交試驗的培養(yǎng)物。根據(jù)3次平行試驗測定的色素(類胡蘿卜素)含量及生物量的平均值，優(yōu)化出適宜的培養(yǎng)基成分及添加量組合。

表1　正交試驗因素及水平設計 　%

1.6　測定指標

1.6.1生物量測定將膠紅酵母培養(yǎng)物、單因素試驗的培養(yǎng)物或正交試驗的培養(yǎng)物80 mL倒入100 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，去掉上清液，將淡紅色的菌體細胞沉淀物用80 mL蒸餾水懸浮，反復離心洗滌數(shù)次，直至上清液無色；將最后一次離心去掉上清液的菌體細胞沉淀物置于50 ℃生化培養(yǎng)箱中，烘干至菌體沉淀物恒定質量，即為膠紅酵母的干菌體，以生物量(g/L)表示。

1.6.2色素含量測定稱取0.1 g干菌體于離心管中，加入3 mol/L的鹽酸溶液5 mL，在室溫下振蕩90 min，再將其放入100 ℃水浴鍋中維持3 min，放入冰塊中快速降溫，4 000 r/min離心10 min，去掉上清液后加入蒸餾水，混勻，用同樣的方法反復離心3次，此時得到膠紅酵母細胞碎片。

收集色素提取液：在細胞碎片中加入5 mL丙酮，搖勻，靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，上清液即為色素提取液。

色素含量測定：在提取液中加入丙酮，定容至15 mL，搖勻，在475 nm波長下測定色素吸光值。色素含量(μg/g)=Aλ×D×V/0.16×W。

式中，Aλ：475 nm的色素吸光值；D：提取液測定時的稀釋倍數(shù)；V：加入丙酮的體積(mL)；W：干菌體的質量(g)。

1.7　生長曲線繪制

1.7.1膠紅酵母發(fā)酵液的制備將膠紅酵母種子液按5%分別接種于12瓶紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)72 h；期間每隔6 h取出1瓶發(fā)酵液，測定膠紅酵母活菌數(shù)和總菌數(shù)。

1.7.2膠紅酵母發(fā)酵液中活菌數(shù)和總菌數(shù)的測定采用血球計數(shù)板法，分別取培養(yǎng)6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h的膠紅酵母發(fā)酵液1 mL，置于滅菌的小試管中，加入1 mL美蘭染色液，混勻后放置2 min，吸取混合液一滴加入到血球計數(shù)板上，光學顯微鏡下觀察，凡是染成藍色的菌體細胞判定為死亡的膠紅酵母，未染色的菌體細胞判定為活的膠紅酵母，二者之和為總菌數(shù)。

1.7.3生長曲線的繪制以膠紅酵母J6發(fā)酵液的培養(yǎng)時間為橫坐標、發(fā)酵液中細菌的數(shù)量為縱坐標，繪制生長曲線。

2　結果與分析

2.1　膠紅酵母培養(yǎng)物的測定結果

膠紅酵母J6接種于紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)物中的生物量是6.423 8 g/L，菌體細胞內色素含量為 131.625 μg/g，色素產量為0.845 5 mg/L。膠紅酵母J6的生物量較少，色素產量較低。

2.2　膠紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗結果

采用控制變量法進行單個因素最適合成分的篩選，用生物量判定優(yōu)化的結果。碳源、氮源、無機鹽及氮源比例的優(yōu)化結果見表2—表5。由表2可知，4種糖中，海藻糖作為碳源時所得的生物量最多，比優(yōu)化前以葡萄糖作為碳源時提高了41.23%。由表3和表4可知，原發(fā)酵培養(yǎng)基以蛋白胨和酵母膏為氮源時，發(fā)酵得到的菌體生物量是8.731 3 g/L，而在此基礎上添加牛肉膏，菌體生物量可以達到10.892 5 g/L，產量提高了24.75%；當?shù)鞍纂?、酵母膏、牛肉膏的比例?∶1∶2時，菌體生物量最大，其次是2∶2∶1。由表5可知，當MnSO4作為無機鹽時，菌體生物量最大，為7.700 0 g/L，比原發(fā)酵培養(yǎng)基提高了16.93%。

表2　不同碳源的生物量　g/L

表3　不同氮源的生物量　g/L

表4　不同氮源比例的生物量　g/L

表5　不同無機鹽的生物量 　g/L

2.3　膠紅酶母發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結果

從單因素優(yōu)化試驗中篩選出的最適合成分：海藻糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、NaCl和MnSO4作為正交試驗的6個測試因素，且固定蛋白胨、酵母膏、牛肉膏的比例為2∶2∶1的正交試驗結果見表6。由表6可知，當各因素以A1B2C2D1E2F1為培養(yǎng)基組合，即2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025%MnSO4時，膠紅酵母J6細胞中的色素含量最高，為331.406 μg/g，比優(yōu)化前提高了151.78%；6個因素中，對色素含量的影響程度從大到小依次是C>A>E>F>B>D，即酵母膏對色素含量影響最明顯，海藻糖次之；當各因素組合為A2B3C1D2E2F3時，即5%海藻糖、3%蛋白胨、1%酵母膏、1%牛肉膏、2% NaCl和0.075% MnSO4時，其生物量最多，為16.791 0 g/L，比優(yōu)化前提高了161.39%；6個因素對生物量的影響程度從大到小依次是E>F>C>B>D>A，即NaCl對生物量的影響最大，而海藻糖最小。

由表7、表8可知，本試驗6個因素對色素含量和生物量的影響均不顯著。

表6　正交試驗結果和極差分析

表7　正交試驗方差分析(以色素含量為分析對象)

表8　正交試驗方差分析(以生物量為分析對象)

2.4　生長曲線的繪制

根據(jù)測定的膠紅酵母J6在發(fā)酵液中的活菌數(shù)和總菌數(shù)繪制出的生長曲線見圖1。由圖1可知，膠紅酵母J6在液體中發(fā)酵時，6～18 h，生長速度較為遲緩；18～36 h，為對數(shù)生長期；36～48 h，為穩(wěn)定期；48～72 h，為衰亡期。

圖1　膠紅酵母J6的生長曲線

3　結論與討論

通過單因素優(yōu)化試驗和正交試驗，優(yōu)化出了膠紅酵母的培養(yǎng)基。色素含量最高的培養(yǎng)基配方是：2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025% MnSO4；菌體生物量最多的培養(yǎng)基配方是：5%海藻糖、3%蛋白胨、1%酵母膏、1%牛肉膏、2% NaCl和0.075%MnSO4；在將來用膠紅酵母J6液體發(fā)酵生產類胡蘿卜素時，建議用2%海藻糖、2%蛋白胨、2%酵母膏、0.5%牛肉膏、2% NaCl和0.025% MnSO4培養(yǎng)基配方，既能獲得較高的色素含量，又能降低培養(yǎng)基成本。

在碳源優(yōu)化中，篩選出海藻糖是理想的碳源。而海藻糖是雙糖分子的新型糖類，具有保水性和抗變性。海藻糖的糖苷鍵在海藻糖酶的作用下能快速釋放2個分子的葡萄糖，相比斷開1個普通糖苷鍵只釋放1個分子的葡萄糖，海藻糖釋放葡萄糖的效能是普通淀粉多聚物的2倍[13]。本試驗結果顯示，以海藻糖為碳源時可使膠紅酵母的生物量提高41.23%。氮源優(yōu)化中，在原發(fā)酵培養(yǎng)基中，增加了牛肉膏，使菌體生物量提高了24.75%；蛋白胨、酵母膏和牛肉膏三者的比例為1∶1∶2和2∶2∶1時，菌體生物量分別為7.892 5 g/L和7.216 3 g/L，考慮到培養(yǎng)基中牛肉膏的價格最貴，故選用蛋白胨、酵母膏和牛肉膏三者比例為2∶2∶1的組合作為最優(yōu)氮源。

張闖[14]研究膠紅酵母培養(yǎng)基配方，得到最優(yōu)組合的生物量為11.38 g/L，類胡蘿卜素含量為120.63 g/L。本試驗優(yōu)化后的培養(yǎng)基可以使膠紅酵母J6的生物量達到16.791 g/L，比原發(fā)酵培養(yǎng)基(6.423 8 g/L)提高了161.39%；色素含量達到331.406 μg/g，比原發(fā)酵培養(yǎng)基(131.625 μg/g)提高了151.78%。

分析正交試驗結果可以看出，生物量最多為16.791 g/L時，其色素含量為282.344 μg/g；而色素含量最高為331.406 μg/g時，生物量只有7.303 7 g/L，菌體生物量與色素含量不呈正相關。而膠紅酵母在生長繁殖過程中產生的色素總量是由其生物量以及色素含量共同決定的，因此，開發(fā)應用膠紅酵母J6時，要根據(jù)實際生產需要來調整培養(yǎng)基的組合，以達到最好的經濟效益。

繪制出了膠紅酵母菌J6生長曲線，明確了其生長的4個時期，優(yōu)化出了培養(yǎng)基，為膠紅酵母菌J6將來作為動物微生態(tài)制劑的開發(fā)應用及作為類胡蘿卜素生產菌種提供了試驗依據(jù)。

參考文獻:

[1]Zhang X,Hua M X,Song C L,etal.Occurrence and diversity of marine yeasts in Antarctica environments[J].Journal of Ocean University of China,2012,11(1):70-74.

[2]Singh P,Singh S M,Tsuji M,etal.Rhodotorulasvalbardensissp.nov.,a novel yeast species isolated from cryoconite holes of Ny-?lesund,Arctic[J].Cryobiology,2014,68(1):122-128.

[3]Prabhakaran N,Gupta R.Yeasts from the sediment samples of the EEZ along the southwest coast of India[J].Journal of the Marine Biological Association of India，1991,33(1/2):455-459.

[4]Connell L,Barrett A,Templeton A,etal.Fungal diversity associated with an active deep sea Volcano:Vailulu’u Seamount,Samoa[J].Geomicrobiology Journal,2009,26(8):597-605.

[5]Hagler A N,Mendoncahagler L C.Yeasts from marine and estuarine waters with different levels of pollution in the state of rio de janeiro,Brazil[J].Applied & Environmental Microbiology,1981,41(1):173-178.

[6]孫建男,劉影,謝為天,等.雷州半島近岸海域海洋紅酵母的分離鑒定[J].熱帶海洋學報,2017,36(4):87-92.

[7]葉偉慶,吳園園,高上吉,等.4株海洋紅酵母分離鑒定及其代謝產物分析[J].熱帶作物學報,2013,34(10):2046-2050.

[8]孫建男,謝為天,徐春厚.海洋紅酵母的研究進展[J].安徽農業(yè)科學,2015,43(4):84-88.

[9]Zhang H Y,Yang Q Y,Ge L L,etal. Chitin enhances biocontrol ofRhodotorulamucilaginosato postharvest decay of peaches[J].International Journal of Biological Macromolecules,2016,88(7):465-475.

[10]汪洋,孔維寶,韓銳,等.紅酵母簡介[J].生物技術通報,2015,50(4):15-17.

[11]尹安偉,路懷燈.海洋紅酵母作為水產飼料添加劑的開發(fā)應用研究[J].科學養(yǎng)魚,2010(5):64-65.

[12]劉琦,辛嘉英.紅酵母及紅酵母產類胡蘿卜素研究進展[J].食品工業(yè)科技,2010,31(3):381-384.

[13]黃梅莓,趙樹銘.海藻糖低溫保護血小板的研究進展[J].局解手術學雜志,2017,26(6):464-467.

[14]張闖.紅酵母發(fā)酵生產類胡蘿卜素的研究[D].大連:大連工業(yè)大學,2011.