低氧微環(huán)境對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖和侵襲的影響

　，　，，　，，　

[1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院老年科，重慶 400038；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，重慶 400038]

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是我國高發(fā)的惡性腫瘤。在2017年出版的世界衛(wèi)生組織公布的《全球癌癥報(bào)告》中，全球范圍內(nèi)的肺癌發(fā)病率和病死率迅速增長(zhǎng)，位居惡性腫瘤的首位[1]。在所有類型肺癌中非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%，其5年生存率僅為13%[2-3]。盡管在過去幾十年間隨著我國醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，新輔助化療和個(gè)體化綜合治療的推廣應(yīng)用，肺癌的早期預(yù)防和治療已經(jīng)取得明顯療效，但是非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后仍然很差，仍然為最常見的和病死率最高的癌癥[4-5]。NSCLC主要致死原因之一是殘余肺癌腫瘤細(xì)胞的異常增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此深入研究肺癌的異常增殖和遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移的分子作用機(jī)制對(duì)于改善肺癌的臨床治療和患者預(yù)后具有重要的臨床意義。在實(shí)體瘤迅速生長(zhǎng)的過程中，短時(shí)間內(nèi)腫瘤細(xì)胞的快速增殖和腫瘤細(xì)胞周圍血管生長(zhǎng)滯后二者間形成一對(duì)矛盾體，由于無法為腫瘤細(xì)胞提供足夠的營養(yǎng)和氧氣，導(dǎo)致腫瘤局部組織中形成缺血缺氧微環(huán)境[6-8]。低氧微環(huán)境能夠進(jìn)一步對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成以及侵襲轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響[9-11]。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12-13]。但有關(guān)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)缺氧條件下的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖活性和侵襲轉(zhuǎn)移的作用,目前尚未見報(bào)道。本研究旨在通過研究體外低氧微環(huán)境對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在這一過程中的可能作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；TRIzol RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；HIF-1α及β-catenin引物均委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技公司設(shè)計(jì)合成；多克隆兔抗人HIF-1α及β-catenin購自美國Santa Cruz公司，單克隆兔抗人β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自武漢博士德生物科技公司；中分子量Protein marker 購自Thermo Fisher公司；ECL 超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒購自武漢碧云天生物科技公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HYCLONE公司；細(xì)胞裂解液(RIPA)及BCA蛋白定量試劑盒均購自武漢碧云天生物科技公司；6孔、96孔培養(yǎng)板、25 cm2塑料培養(yǎng)瓶以及24孔Transwell小室(孔徑8 μm)均購自美國Corning Costar公司；侵襲實(shí)驗(yàn)所用基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國BD公司；Co170R-230-0200三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(用于模擬缺氧細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)購自德國Eppendorf公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移電泳槽均購自北京六一電子儀器公司。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件)下用含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至融合70%～80%后，用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再置入低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。常氧培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、20%O2；低氧培養(yǎng)條件為1%O2。

1.2.2CCK-8測(cè)定不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代肺癌A549細(xì)胞系常規(guī)消化后，按1×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每孔200 μL，并設(shè)空白孔(只加入200 μL培養(yǎng)基)，共接種2塊板。分別置于低氧培養(yǎng)箱及常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于3、6、12、24 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5個(gè)細(xì)胞孔及1個(gè)空白孔行CCK-8檢測(cè)，每孔加入20 μL CCK-8試劑，孵育2 h后取出在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定其吸光值(A)，以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3RNA提取和Real-time PCR檢測(cè)RT-PCR檢測(cè)Wnt/β-catenin的表達(dá)，將已經(jīng)過處理的各組細(xì)胞用冰上預(yù)冷PBS洗滌3次，每孔中加入1 mL Trizol RNA提取液，按照產(chǎn)品說明書操作步驟提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定A260/A280比值，測(cè)算RNA 濃度，重復(fù)3次。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR 循環(huán)擴(kuò)增。PCR所用引物由上海擎科生物科技公司上海分公司合成，引物序列如下：β-actin上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游引物5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’；HIF-1α上游引物5’-CGUACUGCACUCCAAAUATT’，下游引物5’-UAUUUGGAGUGCAGUAGCGTT-3’；β-catenin上游引物5’-GCTGCTGTTTTGTTCCGAATGT-3’，下游引物5’-GCCATTGGCTCTGTTCTGAAGA-3’。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)體系20 μL，mixture 10 μL，探針引物1 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件均為：95 ℃，3 min 預(yù)變性；94 ℃，30 s；48 ℃，30 s，72 ℃，1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像掃描系統(tǒng)成像并進(jìn)行灰度掃描，重復(fù)3 次。

1.2.4Western blot檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧及缺氧培養(yǎng)之后，將6孔板中的貼壁細(xì)胞用冰上預(yù)冷的PBS洗滌3次后加入RIPA細(xì)胞蛋白裂解液，并使用細(xì)胞刮將細(xì)胞裂解液收集轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，冰上靜置裂解30 min，隨后于12 000 rpm離心10 min，棄去細(xì)胞沉淀，取上清液-20 ℃儲(chǔ)存。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，加入5×loading buffer 將蛋白混勻后，置于95 ℃金屬水浴鍋中進(jìn)行蛋白變性。配制12%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V電壓使蛋白分離并使用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束采用5%脫脂牛奶封閉1 h。用多克隆兔抗人的HIF-1α(1∶800)β-catenin、(1∶1 000)、單克隆小鼠抗人的β-actin(1∶3 000)分別與膜接觸4 ℃孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜3次，每次5 min，在加辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑在室溫下反應(yīng)1 min后，進(jìn)行曝光。

1.2.5Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)前所有試劑及器材均于冰上預(yù)冷，將Transwell小室置于6孔板內(nèi)，將Transwell小室內(nèi)膜均勻涂抹0.2 μg/μL的Matrigel 膠(matrigel與無血清培養(yǎng)基之比為1∶250 μL，37 ℃孵育20 min，使膠凝固,并放入培養(yǎng)箱中4 h凝固備用。次日將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌A549細(xì)胞系在無血清DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h后,使用0.25%EDTA胰蛋白酶消化，接著無血清DMEM培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)整至至4×105/mL，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力95%以上。每個(gè)侵襲小室上室中加入無血清細(xì)胞懸液200 μL，在侵襲小室的下室加入含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，每孔600 μL，分別置于常氧和低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后取出小室，用PBS分3次洗滌去除培養(yǎng)基。使用濕棉簽輕柔擦去小室上層未穿過細(xì)胞后置于4%多聚甲醛中固定20 min。隨后將小室置于室溫下晾干并進(jìn)一步使用結(jié)晶紫染色20 min。染色完后在倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)中間及四周5個(gè)高倍(400倍)鏡下視野細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　低氧對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖能力的影響

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧和低氧培養(yǎng)24 h后采用CCK8法進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。結(jié)果顯示：與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖能力顯著增強(qiáng)，而且隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)增殖效應(yīng)越顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1　低氧促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的增殖

2.2　低氧對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549經(jīng)過常氧和低氧培養(yǎng)24 h后采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3　低氧對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

在常氧和低氧環(huán)境下培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 24 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與常氧組相比，低氧組A549的β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明低氧能夠激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路(圖3)。

2.4　靶向沉默β-catenin對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

轉(zhuǎn)染β-catenin特異性siRNA及β-catenin-NC于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 48 h后，分別采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示與β-catenin NC組和空白對(duì)照組相比，β-catenin siRNA組的β-catenin明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5　β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)低氧介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖能力

對(duì)分別進(jìn)行常氧培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。CCK8結(jié)果顯示，與常氧組相比，在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的A549細(xì)胞系隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其增殖能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的細(xì)胞其增殖能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.6　β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)低氧介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

在Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)低氧處理24 h后，與常氧對(duì)照組相比低氧轉(zhuǎn)染NC處理組中A549細(xì)胞的侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA組的細(xì)胞侵襲能力被顯著抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

a:RT-PCR檢測(cè)HIF-1α水平;b:RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA水平;c:Westtern blot檢測(cè)HIF-1α和β-catenin蛋白表達(dá)水平;d、e:Westtern blot結(jié)果定量分析*:P<0.01；#:P<0.001

圖3低氧激活非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的Wnt/β-catenin信號(hào)通路

a：β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染熒光圖(× 200)；b：RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)；c：Western blot檢測(cè)β-catenin 蛋白表達(dá)；d：Western blot結(jié)果定量分析*：P<0.001；#：P<0.01

圖4β-cateninsiRNA在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中有效沉默β-catenin

圖5　β-catenin siRNA抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖

3　討論

肺癌是目前危害人類健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居全球第一，探討其發(fā)生機(jī)制以及尋找有效的治療手段一直是受到廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)之一[14-15]。在正常機(jī)體中，氧濃度的變化對(duì)組織細(xì)胞的代謝、增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。為了適應(yīng)低氧代謝應(yīng)激條件，腫瘤細(xì)胞能夠通過激活一系列信號(hào)調(diào)控機(jī)制，如促進(jìn)周邊新生血管生成、增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝、遷移等，促進(jìn)了細(xì)胞的異常增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等[17-18]。低氧環(huán)境下這一系列生物學(xué)事件的發(fā)生不僅改變了腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，引起腫瘤細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移。作為最常見的實(shí)體瘤，肺癌病灶生長(zhǎng)過程中隨著腫瘤細(xì)胞的快速異常增殖，使得局部血供無法進(jìn)一步支持腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，不可避免地經(jīng)歷局部缺血缺氧微環(huán)境。而在這一過程中適應(yīng)環(huán)境生存下來的腫瘤細(xì)胞的增殖又會(huì)繼續(xù)加劇微環(huán)境的缺氧狀況。在這樣的缺血缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞往往會(huì)通過自分泌或旁分泌作用改變自身周圍生存和發(fā)展的環(huán)境，促進(jìn)腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞本身的一些特征也會(huì)隨之改變，例如具有更強(qiáng)的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處侵襲能力，使其更有利于脫離目前的惡劣環(huán)境，轉(zhuǎn)移到新的部位重新定植。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路廣泛參與生物體內(nèi)細(xì)胞信息調(diào)控，其在細(xì)胞增殖、組織修復(fù)、胚胎發(fā)育及腫瘤(包括肺癌)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[19]。β-catenin是細(xì)胞內(nèi)的一種多功能蛋白，其作為Wnt信號(hào)通路中的核心調(diào)控蛋白主要參與細(xì)胞之間粘附的調(diào)控。正常情況下，正常成熟的組織細(xì)胞中，胞漿內(nèi)β-catenin與細(xì)胞膜上的E-cadherin相互結(jié)合起到促進(jìn)細(xì)胞間粘附的作用。此時(shí)，胞漿內(nèi)游離狀態(tài)的β-catenin濃度維持在較低水平，無法進(jìn)入胞核激活其下游靶基因。當(dāng)細(xì)胞受到各種因素的刺激，使得Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜表面的Frizzled/LRP受體結(jié)合從而磷酸化激活下游分子Dsh，使β-catenin從APC/Ax-in/GSK-3β組成的復(fù)合物中解離出來，使其在細(xì)胞內(nèi)不斷蓄積，并隨后進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF復(fù)合體結(jié)合，最終激活其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖、調(diào)亡、運(yùn)動(dòng)、分化等一系列生物學(xué)事件的調(diào)控[20-21]。研究表明，β-catenin與多種不同的腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要包括肝癌、胃癌以及肺癌等[22-24]，這些研究均顯示β-catenin在這些腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。在肝癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin通過增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,同時(shí)β-catenin表達(dá)水平與肝癌術(shù)后存活時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[25-26]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，低氧通過激活Nur77-β-catenin環(huán)路促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[27]。然而，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道Wnt/β-catenin信號(hào)通路在低氧微環(huán)境下調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力中的調(diào)控機(jī)制。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先驗(yàn)證了體外低氧微環(huán)境對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖與侵襲能力的影響。結(jié)果表明，與常氧對(duì)照組相比，A549細(xì)胞經(jīng)過低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，其增殖速率顯著高于常氧對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞侵襲能力的顯著增強(qiáng)。接下來我們進(jìn)一步研究低氧環(huán)境下這一現(xiàn)象的分子機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，與常氧對(duì)照組相比，低氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h后A549中β-catenin信號(hào)通路顯著激活，提示其可能參與低氧環(huán)境下肺癌的異常增殖和侵襲過程。為了明確Wnt/β-catenin信號(hào)通路在其中的作用機(jī)制。我們采用特異性β-catenin siRNA來阻斷其表達(dá)，并進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在靶向沉默Wnt/β-catenin信號(hào)通路之后，低氧介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲現(xiàn)象被阻斷，表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在這一過程中起著關(guān)鍵作用?；谝陨涎芯?，我們推測(cè)低氧通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的異常增殖和遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移，最終促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展。

a：Tanswell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色 ×200)；b：統(tǒng)計(jì)分析　*：P<0.001

綜上所述，本文初步證實(shí)在肺癌A549細(xì)胞系中低氧微環(huán)境能夠通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖和遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移，這將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肺癌的發(fā)病機(jī)制。因此，深入研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，通過靶向阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子，從而抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，這將為肺癌的特異性治療提供新的思路和依據(jù)，具有廣泛的臨床意義和良好的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Hong QY,Wu GM,Qian GS,et al.Prevention and management of lung cancer in China[J].Cancer,2015,121 (Suppl 17):3080-3088.doi:10.1002/cncr.29584.

[2] Pastorkova Z,Skarda J,Andel J.The role of microRNA in metastatic processes of non-small cell lung carcinoma[J].Biochim Biophys Acta,2016,160(3):343-357.doi:10.5507/bp.2016.021.

[3] Kumarakulasinghe NB,van Zanwijk N,Soo RA.Molecular targeted therapy in the treatment of advanced stage non-small cell lung cancer(NSCLC)[J].Respirology(Carlton,Vic),2015,20(3):370-378.doi:10.1111/resp.12490.

[4] Rafei H,El-Bahesh E,Finianos A,et al.Immune-based therapies for non-small cell lung cancer[J].Anticancer Res,2017,37(2):377-387.doi:10.21873/anticanres.11330.

[5] Durm G,Hanna N.Second-Line chemotherapy and beyond for non-small cell lung cancer[J].Hematol Oncol Clin North Am,2017,31(1):71-81.doi:10.1016/j.hoc.2016.08.002.

[6] Parks K,Cormerais Y,Marchiq I,et al.Hypoxia optimises tumour growth by controlling nutrient import and acidic metabolite export[J].Mol Aspects Med,2016:3-14.doi:10.1016/j.mam.2015.12.001.

[7] Harris BH,Barberis A,West CM,et al.Gene expression signatures as biomarkers of tumour hypoxia[J].Clin Oncol(R Coll Radiol),2015,27(10):547-560.doi:10.1016/j.clon.2015.07.004.

[8] Gilkes DM,Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis[J].Nat Rev Cancer,2014,14(6):430-439.doi:10.1038/nrc3726.

[9] Hubbi ME,Semenza GL.Regulation of cell proliferation by hypoxia-inducible factors[J].Am J Physiol Cell Physiol,2015,309(12):775-782.doi:10.1152/ajpcell.00279.2015.

[10] Madaneckip P,Kapoor N,Bebok Z,et al.Regulation of angiogenesis by hypoxia:the role of microRNA[J].Cell Mol Biol Lett,2013,18(1):47-57.doi:10.2478/s11658-012-0037-0.

[11] Yuen A,Díaz B.The impact of hypoxia in pancreatic cancer invasion and metastasis[J].Hypoxia(Auckl),2014,2:91-106.doi:10.2147/HP.S52636.

[12] Vilchez V,Turcios L,Marti F,et al.Targeting Wnt/beta-catenin pathway in hepatocellular carcinoma treatment[J].World J Gastroenterol,2016,22(2):823-832.doi:10.3748/wjg.v22.i2.823.

[13] Yang Y,Yang JJ,Tao H,et al.New perspectives on beta-catenin control of cell fate and proliferation in colon cancer[J].Food Chem Toxicol,2014,74:14-19.doi:10.1016/j.fct.2014.08.013.

[14] Yand J,Chen J,He J,et al.Wnt signaling as potential therapeutic target in lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2016,20(8):999-1015.2016,20(8):999-1015.doi:10.1517/14728222.2016.1154945.

[15] Sihoe AD,Van Schil P.Non-small cell lung cancer:when to offer sublobar resection[J].Lung cancer(Amsterdam,Netherlands),2014,86(2):115-120.doi:10.1016/j.lungcan.2014.09.004.

[16] Eskandani M,Vandghanooni S,Barar J,et al.Cell physiology regulation by hypoxia inducible factor-1:targeting oxygen-related nanomachineries of hypoxic cells[J].Int J Biol Macromol,2017,99:46-62.doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.10.113.

[17] Marchiq I,Pouysségur J.Hypoxia,cancer metabolism and the therapeutic benefit of targeting lactate/H(+) symporters[J].J Mol Med(Berl),2016,94(2):155-171.doi:10.1007/s00109-015-1307-x.

[18] Manoochehri Khoshinani H,Afshar S,Najafi R.Hypoxia:a double-edged sword in cancer therapy[J].Cancer Invest,2016,34(10):536-545.doi:10.1080/07357907.2016.1245317.

[19] Yao H,Ashihara E,Maekawa T.Targeting the Wnt/beta-catenin signaling pathway in human cancers[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(7):873-887.doi:10.1517/14728222.2011.577418.

[20] Zhang K,Zhang J,Han L,et al.Wnt/beta-catenin signaling in glioma[J].J Neuroimmune Pharmacol,2012,7(4):740-749.doi:10.1007/s11481-012-9359-y.

[21] Guo Y,XiaoL,Sun L,et al.Wnt/beta-catenin signaling:a promising new target for fibrosis diseases[J].Physiol Res,2012,61(4):337-346.

[22] Monga SP.Role of Wnt/beta-catenin signaling in liver metabolism and cancer[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(7):1021-1029.doi:10.1016/j.biocel.2009.09.001.

[23] Cai J,Feng D,Hu L,et al.FAT4 functions as a tumour suppressor in gastric cancer by modulating Wnt/beta-catenin signalling[J].Br J Cancer,2015,113(12):1720-1729.doi:10.1038/bjc.2015.367.

[24] Chen X,Song X,Yue W,et al.Fibulin-5 inhibits Wnt/beta-catenin signaling in lung cancer[J].Oncotarget,2015,6(17):15022-15034.doi:10.18632/oncotarget.3609.

[25] Zhang Q,Bai X,Chen W,et al.Wnt/beta-catenin signaling enhances hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via crosstalk with hif-1alpha signaling[J].Carcinogenesis,2013,34(5):962-973.doi:10.1093/carcin/bgt027.

[26] Liu L,Zhu X D,Wang WQ,et al.Activation of beta-catenin by hypoxia in hepatocellular carcinoma contributes to enhanced metastatic potential and poor prognosis[J].Clin Cancer Res,2010,16(10):2740-2750.doi:10.1158/1078-0432.CCR-09-2610.

[27] To SK,Zeng WJ,Zeng JZ,et al.Hypoxia triggers a Nur77-beta-catenin feed-forward loop to promote the invasive growth of colon cancer cells[J].Br J Cancer,2014,110(4):935-945.doi:10.1038/bjc.2013.816.