姜黃素光動力療法下調(diào)人喉癌細胞中STAT3信號傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平

郭慧，李曉燕，李東波，韓錦華

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院耳鼻喉科，大連 116021)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，具有快速生長、強侵襲力的特點，常用治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，后二者在殺傷腫瘤細胞的同時，也經(jīng)常會損傷正常細胞，光動力療法是隨著激光醫(yī)學(xué)、光纖技術(shù)發(fā)展而日漸興起的針對腫瘤有效的治療方法，可選擇性的殺傷癌癥細胞而較少損傷正常組織的方法[1]。光敏劑是引起光動力發(fā)生的重要因素之一。姜黃素不僅本身可以產(chǎn)生抗癌作用[2]，而且還被發(fā)現(xiàn)具有光敏劑的作用，具有高效、安全、少副作用、反復(fù)使用和成本相對低等優(yōu)點，應(yīng)用于光動力治療中[3]。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是細胞質(zhì)中酪氨酸磷酸化信號傳導(dǎo)通路中的一種雙功能蛋白，在腫瘤組織（包括喉癌）內(nèi)高表達，被認為是一種原癌基因[4-6]。

本實驗旨在通過激光照射姜黃素，了解其對人喉癌Hep-2細胞系增殖、凋亡及STAT3傳導(dǎo)通路調(diào)控蛋白p-STAT3、cyclin Dl和Bcl-2水平的影響，為進一步了解姜黃素抗癌作用的機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑、抗體與細胞株

人鱗狀喉癌細胞株Hep-2（本實驗室保存），RPMI1640培養(yǎng)基，濃縮型磷酸化STAT3兔抗人單克隆抗體（p-STAT3，針對705位酪氨酸磷酸化位點）和B淋巴細胞2（Bcl-2）鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司），cyclin D1蛋白多克隆抗體購自北京賽弛生物科技有限公司，姜黃素購自Sigma公司。

2 細胞培養(yǎng)和實驗分組

人喉癌Hep-2細胞株置于37.0℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含10%小牛血清、1%青霉素及鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)細胞培養(yǎng)、傳代。實驗分組：空白對照組（既不加光敏劑也不照光，A組），光對照組（不加光敏劑的單純照光對照組，B組），光敏劑對照組（只加光敏劑不照光的光敏劑對照組，C組），光敏劑處理組（同時光敏劑和照光，D組）。

3 細胞的光敏劑處理

將培養(yǎng)的人喉癌細胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化、吹打，制成單細胞懸液。分別接種于96孔和6孔培養(yǎng)板上，置于37.0℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，嚴格避光條件下，加濃度為5μmol/L光敏劑，在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育8h，然后照光。

4 細胞的照光處理

用波長為445nm的激光進行照射，光斑直徑為1.0cm，通過光導(dǎo)纖維使激光均勻垂直地照射到細胞培養(yǎng)板（6孔板用于細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測，96孔板用于細胞增殖檢測），監(jiān)測照射前后激光輸出功率的變化，控制其變化幅度＜5%，光照的功率密度為50mW/cm2，照射時間為2min，光照能量為100J/cm2，照光時注意不照光的孔應(yīng)避光。

5 細胞增殖的MTT法檢測

上述經(jīng)過光動力治療的細胞，加入5g/L MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入甲臜200μl，酶標儀測定490nm各孔吸光度A值，并按照公式（增殖抑制率=[（對照組A值－實驗組A值）/對照組A值]×100%，抑制率﹥30%，即對該藥敏感性高）計算抑制率。

6 細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測

上述4組經(jīng)過光動力治療的喉癌細胞制成單細胞混懸液， PBS處理，在70%冰乙醇中固定，37℃水浴1h，加入10%雞血紅細胞作為內(nèi)參，與樣本同步染色，加入碘化丙啶（PI）染液，4℃避光染色30min，然后流式細胞儀進行測定（美國Beckman Coulter公司，Epics-XL Ⅱ型） ，激發(fā)波長488nm，630nm帶通濾光片接收，利用前散射光/側(cè)散射光散點圖收集細胞共10000個，排除細胞碎片和拈連細胞，得出并分析PI熒光直方圖上面凋亡細胞比例。

7 流式細胞術(shù)檢測STAT3信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平

經(jīng)過光動力治療后，用胰酶消化各組實驗細胞，然后將細胞制成混懸液，無血清狀態(tài)下繼續(xù)培育細胞16～24h， PBS處理，固定于4%多聚甲醛中，冰浴避光40min，離心5min，倒掉上清；PBS清洗，離心，4%多聚甲醛常溫固定；然后用1ml（5%血清+0.2% Trion-X 100）培養(yǎng)液重懸，繼續(xù)冰浴、離心，p-STAT3、cyclin Dl、Bcl-2鼠單克隆抗體冰浴10min后，離心、清洗，繼而分別加入對應(yīng)的FITC標記的二抗；避光冰浴、清洗、離心，重懸細胞后流式細胞儀檢測。以熒光指數(shù)（FI）表示蛋白的相對含量。FI=樣品蛋白表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度（樣品的均道值/對照組的均道值）；均道值=log（x-mode）值×340，如果FI＞1.0為陽性表達，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達。

8 統(tǒng)計學(xué)方法

將數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel軟件處理，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組間比較實行單因素方差變量分析，組間兩兩比較采用Dunnett T 3（方差不齊）或LSD- t檢驗（方差齊），P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 光動力治療后Hep-2細胞形態(tài)的觀察

空白對照組的細胞數(shù)目較多，細胞貼壁狀況良好，細胞透明，呈棱形或多角形，細胞伸展性良好，細胞膜清楚，細胞質(zhì)均勻、核大、核仁清楚；而光動力治療組細胞貼壁情況欠佳明顯，細胞皺縮、形態(tài)不規(guī)則，胞核染色質(zhì)濃縮，細胞數(shù)目減少，懸浮細胞數(shù)增加。另外二組細胞略有皺縮改變、細胞數(shù)目減少（圖1）。

圖1 光動力治療后Hep-2細胞的形態(tài)變化。A，A組(既不加光敏劑又不照光的空白對照組)；B，B組（不加光敏劑的單純照光對照組）；C， C組（只加光敏劑不照光的光敏劑對照組）；D，D組（光敏劑處理實驗組）；比例尺，50μmFig. 1 Morphological changes of hep-2 cells after photodynamic therapy. A, group A received no light and photosensitizer as blank control; B, group B were exposed to light but no photosensitizer as light control; C, group C were treated with photosensitizer but no light exposure as photosensitizer control; D, group D received both light and photosensitizer; scale bar, 50μm

2 光動力處理抑制細胞生長

MTT法檢測顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）可顯著抑制喉癌細胞增殖，抑制率分別為（41.35±4.12）%和（45.14±5.78）%，顯著高于空白對照組（A組）的（4.89±2.14）%；而同時光敏劑和照光（D組）可進一步抑制喉癌細胞增殖，抑制率高達（65.12±5.89）%，顯著高于B組和C組（表1）。

表1 光動力處理對Hep-2細胞增殖抑制率（IR）和凋亡率（AR）影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab.1 Statistical analysis for the effect of photodynamic therapy on the inhibitory rate (IR) of proliferation and apoptosis rate(AR) in Hep-2 cells

3 光動力處理促進細胞凋亡

碘化丙啶（PI）流式細胞術(shù)分析顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）可顯著增加喉癌細胞凋亡，凋亡率分別為（24.56±1.89）%和（26.69±2.36）%，顯著高于空白對照組（A組）的（21.56±2.67）%；而同時光敏劑和照光（D組）可進一步增加喉癌細胞凋亡，凋亡率高達（50.12±2.38）%，顯著高于B組和C組（表1）。

4 光動力照射下調(diào)STAT3信號傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平

免疫熒光流式細胞術(shù)檢測STAT3信號通路相關(guān)調(diào)控蛋白水平顯示，單純照光（B組）或單純光敏劑處理（C組）中p-STAT3、Bcl-2和cyclin D1水平較空白對照（A組）降低，而同時光敏劑和照光（D組）p-STAT3、Bcl-2和cyclin D1水平進一步降低，不僅低于A組，還明顯低于B組和C組（表2）。

表2光動力照射對喉癌細胞P-SRAT3, Bcl-2, cyclin D1水平影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab.2 Statistical analysis for the effect of photodynamic therapy on the levels of p-SRAT3, Bcl-2, and cyclin D1 in hep-2 cells

討 論

光動力學(xué)療法（Photodynamic therapy，PDT）是上世紀70年代發(fā)現(xiàn)的腫瘤治療的新方法[7]。該方法將光敏劑（photosensitizer）通過靜脈注射入人體后，有限時間內(nèi)光敏劑可以在癌組織中蓄積，使用特定波長激光照射癌組織，可以直接激活癌組織內(nèi)的光敏劑分子，引起光化學(xué)反應(yīng)，生成強活性的單態(tài)氧，單態(tài)氧和生物大分子產(chǎn)生氧化反應(yīng)，利用細胞毒作用達到殺死腫瘤細胞的目的[8]。光敏劑是光動力發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，激活后的光敏劑還可以破壞腫瘤組織內(nèi)的微血管，使腫瘤組織產(chǎn)生缺血性壞死。因為組織中光敏劑半衰期不同，所以光敏劑在正常細胞可以快速代謝，在癌組織內(nèi)可以蓄積，所以其只針對癌組織起作用。激活后的光敏劑既可以使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)錄、細胞周期調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)等轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及生物學(xué)行為的變化[9]，又可以利用壞死、凋亡、自嗜等手段殺死腫瘤細胞[10]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素本身具有光敏劑的特性，將姜黃素溶于二甲基亞砜中，然后分別使用熒光分光光度計和紫外分光光度計檢測姜黃素的熒光發(fā)射光譜、吸收光譜、激發(fā)光譜，發(fā)現(xiàn)姜黃素在200～230nm和410～450nm處各有一吸收峰，其熒光最大發(fā)射波長為530nm，最大激發(fā)波長為425nm[11]。相對于血卟啉類光敏劑姜黃素不僅能在腫瘤組織中聚積，而且全身清除率較快，減少了患者避光時間和光敏反應(yīng)。

在我國頭頸部惡性腫瘤中鼻咽癌、喉癌較為常見，該處的腫瘤常通過手術(shù)、放化療等手段控制，但由于頭頸部解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，手術(shù)切除易引起容貌的毀損或組織器官功能喪失，放療有時會發(fā)生難逆轉(zhuǎn)、難治愈且預(yù)后較差的放射性腦病，尤其是對首次治療失敗、局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的晚期患者這些傳統(tǒng)的治療方法難以取得理想的療效。而光動力學(xué)療法，對淺表性癌前期病變和早期癌腫，尤其是彌散性病變效果良好；對于深入的、進展期癌腫，特別適用于不能耐受手術(shù)、禁忌放化療或治療失敗的患者，包括耳、鼻、咽、喉、消化道等處的癌腫，可明顯地改善患者病癥，提高生活質(zhì)量和延長生存期。

在胞外信號的刺激下STAT3發(fā)生磷酸化后進入細胞核，結(jié)合于特定的DNA啟動子序列上，通過誘導(dǎo)細胞周期控制基因c-Myc、cyclin D1和抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-xl、survivin和以及誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等重要基因的異常表達，表現(xiàn)出促進細胞惡性轉(zhuǎn)化、增殖、血管形成、阻礙細胞凋亡等致癌作用［1-3］。

正常細胞中，細胞的增殖是利用有絲分裂，即細胞難逆轉(zhuǎn)的進入至終末分化階段進行調(diào)控， STAT3可以調(diào)控cyclin D1基因，高表達cyclin D1基因可以促使細胞周期前進，加速腫瘤細胞的增殖。STAT3的持續(xù)高活性可以引起抑凋亡基因Bcl-xl的高表達，抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同時可以抑制細胞中Bcl-xl的表達。

本實驗中我們觀察到當(dāng)含有藥物姜黃素的Hep-2細胞被激光照射后，喉癌細胞抑制率明顯升高，細胞凋亡率明顯增加，p-STAT3蛋白表達與活性下調(diào)，影響了STAT3傳導(dǎo)通路相關(guān)調(diào)控蛋白cyclin Dl、Bcl-2的表達，進而抑制喉癌細胞的增殖，促進其凋亡，推測其原因之一是姜黃素可以直接引起細胞死亡，另外被激發(fā)后的姜黃素作為光敏劑也可以抑制p-STAT3 、cyclin Dl、Bcl-2表達從而起到作用。本實驗從驗證了姜黃素作為光敏劑的對喉癌的治療作用，為頭頸部鱗癌患者的綜合治療提供了新的理論依據(jù)。

[1] Tian J, Ding L, Xu HJ, et, al. Cell-specific and pH-activatable rubyrin-loaded nanoparticles for highly selective near-infrared photodynamic therapy against cancer. J Am Chem Soc, 2013, 135(50): 18850-18858.

[2] Waghela BN, Sharma A, Dhumale S, et al. Curcumin conjugated with PLGA potentiates sustainability, anti-proliferative activity and apoptosis in human colon carcinoma cells.PLoS One, 2015, 10(2): e0117526.

[3] Araujo NC, Fontana CR, Bagnato VS, et al. Photodynamic antimicrobial therapy of curcumin in bio fi lms and carious dentine. Lasers Med Sci, 2014, 29(2): 629-635.

[4] Yu H, Lee H, Herrmann A, et al. Revisting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological function. Nat Rev Cancer, 2014, 14(11): 736-746.

[5] Geiger JL, Grandis JR, Bauman JE. The STAT3 pathway as a therapeutic targer in head and neck cancer: Barries and innovations .Oral oncology, 2016, (56): 84-92.

[6] Yuan J, Zhang F, Niu R. Multiple regulation pathways and pivotal bio logical function of STAT3 in cancer. Scienti fi c report, 2015, ( 5): 17663.

[7] Kim CH, Chung CW, Choi KH, et al. Effect of 5-aminolevulinicacid-based photodynamic therapy via reactive oxygen species in human cholangio carcinoma cells. Int J Nanomedicine, 2011, (6):1357-1363.

[8] Cecic I, Korbelik M. Mediators of peripheral blood neutrophilia in duced by photodynamic therapy of solid tumors.Cancer Lett, 2002, 183(1): 43-51.

[9] Saikali S, Avril T, Collet B et al. Expression of nine tumour antigens in a series of human glioblastoma multiforme:interest of EGFRvⅢ , IL-13Ralpha2, gp100 and TRP-2 for immunotherapy. J Neurooncol, 2007, 81(2): 139-148.

[10] Dewaele M, Verfaillie T, Martinet W, et al. Death and survival signals in photodynamic therapy.Methods Mol Biol,2010, 635: 7-33.

[11] 許川山，Albert Wing Nang Leung. 中藥姜黃素的光譜學(xué)特性研究. 激光雜志，2015，26（4）：86.