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      網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)改進(jìn)

      2018-04-03 07:17:58鄭海燕方慶全索文昊
      關(guān)鍵詞:沉渣網(wǎng)狀清晰度

      鄭海燕,方慶全,索文昊

      (廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科,廈門(mén) 361003)

      網(wǎng)狀纖維存在于機(jī)體任何組織與器官,通過(guò)網(wǎng)狀纖維染色觀察病變組織中網(wǎng)狀纖維的多少、粗細(xì)、疏密、有無(wú)斷裂、有無(wú)塌陷等形態(tài)變化,對(duì)判斷病變性質(zhì)、程度、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸具有重要意義[1]。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀纖維染色有如下不足:用于網(wǎng)狀纖維染色的氨銀液配制皆較復(fù)雜;配制的氨銀液有效期短,易造成浪費(fèi);染色背景常有銀顆粒沉渣;染色過(guò)程中容易脫片;染色結(jié)果網(wǎng)狀纖維和膠原纖維對(duì)比度欠佳。針對(duì)這些問(wèn)題,我們改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色氨銀液配制方法和網(wǎng)狀纖維染色方法,可提高氨銀液配制的成功率,延長(zhǎng)氨銀液有效期,提高網(wǎng)狀纖維的染色質(zhì)量,減少網(wǎng)狀纖維染色的脫片率。

      材料與方法

      1 試劑

      硝酸銀,氫氧化鉀,蒸餾水,濃氨水,高錳酸鉀,草酸,硫酸鐵銨,甲醛,氯化金,硫代硫酸鈉,乙醇,濾紙。

      2 氨銀液配制方法的改進(jìn)

      由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色的氨銀液配制較為復(fù)雜且有效期較短,在JCI“持續(xù)質(zhì)量改進(jìn)”理念指導(dǎo)下,廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科對(duì)氨銀液配制方法進(jìn)行改進(jìn)(表1)。

      氨銀液配制成功率:收集傳統(tǒng)方法與改進(jìn)方法配制的氨銀液各30份,統(tǒng)計(jì)其配制成功率。傳統(tǒng)配制法成功率為80.0%(24/30),改進(jìn)配制法成功率為100.0%(30/30),改進(jìn)配制法成功率顯著高于傳統(tǒng)配制法(χ2=4.29,0.01<P < 0.05)。

      表1 兩種氨銀液配制流程比較Tab.1 Comparison on two preparation procedures of ammonia silver solution

      氨銀液有效期:同樣置于4℃冰箱內(nèi)保存,傳統(tǒng)方法配制成功的24份氨銀液有效期均數(shù)為2.85±0.28周,改進(jìn)方法配制30份氨銀液有效期均數(shù)為6.39±0.27周,改進(jìn)方法配制氨銀液的有效期顯著長(zhǎng)于傳統(tǒng)配制法(t=9.01,P<0.01)。

      3 網(wǎng)狀纖維染色方法的改進(jìn)

      由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色存在以下缺點(diǎn):背景常有銀顆粒沉渣、染色過(guò)程易脫片、網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳等,廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科在改進(jìn)氨銀液配制方法的基礎(chǔ)上,改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色方法如下:①減少高錳酸鉀氧化、及其后續(xù)的蒸餾水洗、草酸水溶液漂白、蒸餾水洗的時(shí)間;②2%硫酸鐵銨水溶液媒染后,不經(jīng)自來(lái)水洗,直接蒸餾水洗;③氨銀溶液作用前,裁剪略大于組織的濾紙鋪于切片的組織上,再滴加改良氨銀溶液覆蓋濾紙表面,染10~15min。④氨銀溶液作用后,不傾倒掉氨銀液,直接用蒸餾水從一側(cè)迅速?zèng)_洗掉氨銀液。⑤10%甲醛溶液還原數(shù)秒即可。⑥0.2%氯化金溶液調(diào)色數(shù)秒至1min,以肉眼觀由棕黃色變灰黑,再鏡下控制(表2)。收集80例富含網(wǎng)狀纖維組織的肝組織病例,每例連續(xù)切片2片,厚度為3.5μm,常規(guī)脫蠟后隨機(jī)分為2組,1組用傳統(tǒng)方法進(jìn)行網(wǎng)狀纖維染色(A組),另1組用改進(jìn)方法進(jìn)行染色(B組),比較2組的染色效果。

      4 評(píng)價(jià)指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

      設(shè)定以下3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo):背景清潔度、網(wǎng)狀纖維清晰度、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:①背景清潔度(100分):放大200倍鏡下,切片背景見(jiàn)少量散在顆粒沉渣,不影響診斷,減1~10分;見(jiàn)少量散在及成團(tuán)顆粒沉渣,不影響診斷,減11~20分;見(jiàn)多量散在顆粒沉渣,部分覆蓋網(wǎng)狀纖維,影響觀察,減21~40分;見(jiàn)多量散在及成團(tuán)顆粒沉渣,影響診斷,減41~100分。②網(wǎng)狀纖維清晰度(100分):網(wǎng)狀纖維染色輕度淡染,結(jié)構(gòu)尚可分辨,減1~10分;網(wǎng)狀纖維與背景染色均輕--中度過(guò)深或過(guò)淺,網(wǎng)狀纖維清晰度較差,減11~30分;網(wǎng)狀纖維與背景染色均重度過(guò)深或過(guò)淺,影響觀察,減31~100分。③網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度(網(wǎng)狀纖維呈黑色,膠原纖維呈黃棕為優(yōu)質(zhì)的網(wǎng)狀纖維染色,100分):網(wǎng)狀纖維染色輕度淡染,膠原纖維輕度深染,兩者對(duì)比度尚可,減1~10分;網(wǎng)狀纖維染色中度淡染,膠原纖維中度深染,兩者對(duì)比度較差,減11~30分;網(wǎng)狀纖維與膠原纖維均呈灰黑色或近似黃棕色,兩者對(duì)比度差,減31~100分。由2名副主任以上醫(yī)師對(duì)A、B 2組的染色片進(jìn)行雙盲評(píng)分,每項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)為評(píng)分的平均值。

      5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)兩兩比較,以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      A、B兩組染色結(jié)果比較見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn),A組背景清潔度、網(wǎng)狀纖維清晰度、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度3項(xiàng)指標(biāo)的得分與B組。A組染色片(圖1A)背景見(jiàn)多量沉渣、清潔度較差,網(wǎng)狀纖維清晰度較差,網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度差;B組染色片(圖1B)背景見(jiàn)未見(jiàn)明顯沉渣、清潔度好,網(wǎng)狀纖維清晰度好,網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度好。比較兩組脫片率顯示,B組脫片率(1.3%)明顯低于A組脫片率(11.3%)(χ2=6.83,P<0.01)。

      表2 兩種網(wǎng)狀纖維染色方法流程比較Tab. 2 Comparison on two reticular fi ber staining methods

      表3 兩組染色結(jié)果比較Tab. 3 Comparison on staining results between two groups

      討 論

      網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中主要用于:①顯示與鑒別腫瘤的性質(zhì)、來(lái)源;②某些腫瘤的診斷[4];③觀察和研究癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其惡性程度;④顯示與觀察組織中基底膜的變化;⑤識(shí)別壞死組織的結(jié)構(gòu)及類(lèi)型;⑥顯示和研究肝組織病變。所以網(wǎng)狀纖維染色是日常病理工作中不可或缺的一種染色方法,簡(jiǎn)化及穩(wěn)定的染色技術(shù)在日益繁忙的病理科工作中顯得尤為重要。

      網(wǎng)狀纖維染色中使用的氨銀液是一種絡(luò)合物,對(duì)組織有較強(qiáng)的親和力,與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合,再經(jīng)甲醛還原成為銀后沉積于網(wǎng)狀纖維內(nèi)及其表面,得以顯色。配制氨銀液時(shí),所用的10%硝酸銀水溶液不宜太多,氨水必須新鮮,逐滴加入濃氨水,一邊滴加一邊搖勻震蕩,以嚴(yán)格控制所滴加的濃氨水劑量。氨水若滴加過(guò)量,會(huì)不同程度地降低氨銀液染色敏感性,使網(wǎng)狀纖維染色過(guò)淺,氨過(guò)量也易導(dǎo)致脫片,以邊滴加邊搖動(dòng),直至溶液只有少量微顆粒為佳。

      圖1 A、B 兩組染色結(jié)果比較。A,背景見(jiàn)多量沉渣、清潔度較差,網(wǎng)狀纖維(黑箭頭)清晰度較差,網(wǎng)狀纖維與膠原纖維(紅箭頭)對(duì)比度差;B,背景見(jiàn)未見(jiàn)明顯沉渣、清潔度好,網(wǎng)狀纖維(黑箭頭)清晰度好,網(wǎng)狀纖維與膠原纖維(紅箭頭)對(duì)比度好,肝血竇內(nèi)皮下網(wǎng)狀纖維呈黑色,匯管區(qū)膠原纖維呈棕紅色;比例尺,100μmFig.1 Comparison of staining results between 2 groups. A, traditional staining method showed a lot of sediment and poor background cleanliness, low clarity of reticular fi ber, poor contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); B, improved new method showed no obvious sediment, cleaner background, higher clarity of reticular fi ber, good contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); scale bar, 100μm

      由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色方法存在諸多缺點(diǎn),其主要原因如下:①高錳酸鉀是強(qiáng)氧化劑,0.25%高錳酸鉀水溶液氧化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)是染色過(guò)程易脫片的重要原因;②高錳酸鉀水溶液氧化后續(xù)的蒸餾水洗、草酸水溶液漂白、蒸餾水洗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也是染色過(guò)程易脫片的原因;③2%硫酸鐵銨水溶液媒染后,自來(lái)水洗后再蒸餾水洗,蒸餾水沖洗不徹底時(shí),自來(lái)水殘余的氯離子會(huì)與金屬銀反應(yīng)而導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維清晰度差、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度差,甚至導(dǎo)致脫片;④直接滴加Gomori氏氨銀溶液在切片上及其后的蒸餾水沖洗方法欠佳,導(dǎo)致切片背景銀顆粒沉渣多,也影響切片染色質(zhì)量;⑤10%甲醛溶液還原時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致脫片;⑥0.2%氯化金溶液調(diào)色過(guò)度導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳。針對(duì)傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色背景不清晰、染色過(guò)程易脫片、網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳等問(wèn)題,我們對(duì)傳統(tǒng)染色方法進(jìn)行了持續(xù)改進(jìn),主要措施包括:調(diào)整部分染色步驟的作用時(shí)間;整個(gè)染色過(guò)程避免使用自來(lái)水沖洗;裁剪略大于組織的濾紙鋪于組織上,氨銀液染色步驟結(jié)束后不直接傾倒掉液體而是以蒸餾水直接沖洗;氨銀液染色后以蒸餾水速洗后即刻滴加10%甲醛溶液還原;由于蒸餾水洗有分化作用,時(shí)間應(yīng)控制好,否則易染色淺淡;以甲醛分析純?nèi)芤汉驼麴s水按1:9的比例配制10%甲醛溶液;氯化金調(diào)色步驟以肉眼觀組織由棕黃色變灰黑,再鏡下控制等等。其中較為關(guān)鍵的染色技巧是:裁剪略大于組織的濾紙鋪于組織上,再滴加氨銀液覆蓋濾紙表面10~15min,至濾紙表面形成一圈肉眼可見(jiàn)的銀顆粒為宜,如果銀顆粒不明顯,可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間,用濾紙的效果是背景干凈無(wú)沉渣。

      我們的實(shí)踐證明,改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色氨銀液配制方法、改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色方法,可提高氨銀液配制的成功率,延長(zhǎng)氨銀液有效期,提高網(wǎng)狀纖維的染色質(zhì)量,減少網(wǎng)狀纖維染色的脫片率。

      [1] 聶艷紅,王紅霞,劉慧,等. 網(wǎng)狀纖維染色及P504S在胰腺實(shí)性假乳頭狀瘤鑒別診斷中的價(jià)值.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(7):799-801.

      [2] 孫志華. 基于JCI核心理念的ICU患者安全目標(biāo)持續(xù)改進(jìn)的護(hù)理實(shí)踐.中華現(xiàn)代護(hù)理雜志,2015,21(24):2912-2915.

      [3] 田媛媛,唐正利. 我院ICU多重耐藥菌感染管理實(shí)踐. 中華醫(yī)院管理雜志,2017,33(1):56-57.

      [4] 王德田,董建強(qiáng). 實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù). 北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2013:91.

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