網(wǎng)狀纖維染色技術(shù)改進(jìn)

鄭海燕，方慶全，索文昊

（廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門(mén) 361003）

網(wǎng)狀纖維存在于機(jī)體任何組織與器官，通過(guò)網(wǎng)狀纖維染色觀察病變組織中網(wǎng)狀纖維的多少、粗細(xì)、疏密、有無(wú)斷裂、有無(wú)塌陷等形態(tài)變化，對(duì)判斷病變性質(zhì)、程度、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸具有重要意義[1]。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)網(wǎng)狀纖維染色有如下不足：用于網(wǎng)狀纖維染色的氨銀液配制皆較復(fù)雜；配制的氨銀液有效期短，易造成浪費(fèi)；染色背景常有銀顆粒沉渣；染色過(guò)程中容易脫片；染色結(jié)果網(wǎng)狀纖維和膠原纖維對(duì)比度欠佳。針對(duì)這些問(wèn)題，我們改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色氨銀液配制方法和網(wǎng)狀纖維染色方法，可提高氨銀液配制的成功率，延長(zhǎng)氨銀液有效期，提高網(wǎng)狀纖維的染色質(zhì)量，減少網(wǎng)狀纖維染色的脫片率。

材料與方法

1 試劑

硝酸銀，氫氧化鉀，蒸餾水，濃氨水，高錳酸鉀，草酸，硫酸鐵銨，甲醛，氯化金，硫代硫酸鈉，乙醇，濾紙。

2 氨銀液配制方法的改進(jìn)

由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色的氨銀液配制較為復(fù)雜且有效期較短，在JCI“持續(xù)質(zhì)量改進(jìn)”理念指導(dǎo)下，廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科對(duì)氨銀液配制方法進(jìn)行改進(jìn)（表1）。

氨銀液配制成功率：收集傳統(tǒng)方法與改進(jìn)方法配制的氨銀液各30份，統(tǒng)計(jì)其配制成功率。傳統(tǒng)配制法成功率為80.0%（24/30），改進(jìn)配制法成功率為100.0%（30/30），改進(jìn)配制法成功率顯著高于傳統(tǒng)配制法（χ2=4.29，0.01＜P ＜ 0.05）。

表1 兩種氨銀液配制流程比較Tab.1 Comparison on two preparation procedures of ammonia silver solution

氨銀液有效期：同樣置于4℃冰箱內(nèi)保存，傳統(tǒng)方法配制成功的24份氨銀液有效期均數(shù)為2.85±0.28周，改進(jìn)方法配制30份氨銀液有效期均數(shù)為6.39±0.27周，改進(jìn)方法配制氨銀液的有效期顯著長(zhǎng)于傳統(tǒng)配制法（t=9.01，P＜0.01）。

3 網(wǎng)狀纖維染色方法的改進(jìn)

由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色存在以下缺點(diǎn)：背景常有銀顆粒沉渣、染色過(guò)程易脫片、網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳等，廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科在改進(jìn)氨銀液配制方法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色方法如下：①減少高錳酸鉀氧化、及其后續(xù)的蒸餾水洗、草酸水溶液漂白、蒸餾水洗的時(shí)間；②2%硫酸鐵銨水溶液媒染后，不經(jīng)自來(lái)水洗，直接蒸餾水洗；③氨銀溶液作用前，裁剪略大于組織的濾紙鋪于切片的組織上，再滴加改良氨銀溶液覆蓋濾紙表面，染10～15min。④氨銀溶液作用后，不傾倒掉氨銀液，直接用蒸餾水從一側(cè)迅速?zèng)_洗掉氨銀液。⑤10%甲醛溶液還原數(shù)秒即可。⑥0.2%氯化金溶液調(diào)色數(shù)秒至1min，以肉眼觀由棕黃色變灰黑，再鏡下控制（表2）。收集80例富含網(wǎng)狀纖維組織的肝組織病例，每例連續(xù)切片2片，厚度為3.5μm，常規(guī)脫蠟后隨機(jī)分為2組，1組用傳統(tǒng)方法進(jìn)行網(wǎng)狀纖維染色（A組），另1組用改進(jìn)方法進(jìn)行染色（B組），比較2組的染色效果。

4 評(píng)價(jià)指標(biāo)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

設(shè)定以下3項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)：背景清潔度、網(wǎng)狀纖維清晰度、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：①背景清潔度（100分）：放大200倍鏡下，切片背景見(jiàn)少量散在顆粒沉渣，不影響診斷，減1～10分；見(jiàn)少量散在及成團(tuán)顆粒沉渣，不影響診斷，減11～20分；見(jiàn)多量散在顆粒沉渣，部分覆蓋網(wǎng)狀纖維，影響觀察，減21～40分；見(jiàn)多量散在及成團(tuán)顆粒沉渣，影響診斷，減41～100分。②網(wǎng)狀纖維清晰度（100分）：網(wǎng)狀纖維染色輕度淡染，結(jié)構(gòu)尚可分辨，減1～10分；網(wǎng)狀纖維與背景染色均輕--中度過(guò)深或過(guò)淺，網(wǎng)狀纖維清晰度較差，減11～30分；網(wǎng)狀纖維與背景染色均重度過(guò)深或過(guò)淺，影響觀察，減31～100分。③網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度（網(wǎng)狀纖維呈黑色，膠原纖維呈黃棕為優(yōu)質(zhì)的網(wǎng)狀纖維染色，100分）：網(wǎng)狀纖維染色輕度淡染，膠原纖維輕度深染，兩者對(duì)比度尚可，減1～10分；網(wǎng)狀纖維染色中度淡染，膠原纖維中度深染，兩者對(duì)比度較差，減11～30分；網(wǎng)狀纖維與膠原纖維均呈灰黑色或近似黃棕色，兩者對(duì)比度差，減31～100分。由2名副主任以上醫(yī)師對(duì)A、B 2組的染色片進(jìn)行雙盲評(píng)分，每項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)為評(píng)分的平均值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)兩兩比較，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

A、B兩組染色結(jié)果比較見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，A組背景清潔度、網(wǎng)狀纖維清晰度、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度3項(xiàng)指標(biāo)的得分與B組。A組染色片（圖1A）背景見(jiàn)多量沉渣、清潔度較差，網(wǎng)狀纖維清晰度較差，網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度差；B組染色片（圖1B）背景見(jiàn)未見(jiàn)明顯沉渣、清潔度好，網(wǎng)狀纖維清晰度好，網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度好。比較兩組脫片率顯示，B組脫片率（1.3%）明顯低于A組脫片率（11.3%）（χ2=6.83，P＜0.01）。

表2 兩種網(wǎng)狀纖維染色方法流程比較Tab. 2 Comparison on two reticular fi ber staining methods

表3 兩組染色結(jié)果比較Tab. 3 Comparison on staining results between two groups

討 論

網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中主要用于：①顯示與鑒別腫瘤的性質(zhì)、來(lái)源；②某些腫瘤的診斷[4]；③觀察和研究癌組織的發(fā)生、發(fā)展及其惡性程度；④顯示與觀察組織中基底膜的變化；⑤識(shí)別壞死組織的結(jié)構(gòu)及類(lèi)型；⑥顯示和研究肝組織病變。所以網(wǎng)狀纖維染色是日常病理工作中不可或缺的一種染色方法，簡(jiǎn)化及穩(wěn)定的染色技術(shù)在日益繁忙的病理科工作中顯得尤為重要。

網(wǎng)狀纖維染色中使用的氨銀液是一種絡(luò)合物，對(duì)組織有較強(qiáng)的親和力，與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合，再經(jīng)甲醛還原成為銀后沉積于網(wǎng)狀纖維內(nèi)及其表面，得以顯色。配制氨銀液時(shí)，所用的10%硝酸銀水溶液不宜太多，氨水必須新鮮，逐滴加入濃氨水，一邊滴加一邊搖勻震蕩，以嚴(yán)格控制所滴加的濃氨水劑量。氨水若滴加過(guò)量，會(huì)不同程度地降低氨銀液染色敏感性，使網(wǎng)狀纖維染色過(guò)淺，氨過(guò)量也易導(dǎo)致脫片，以邊滴加邊搖動(dòng)，直至溶液只有少量微顆粒為佳。

圖1 A、B 兩組染色結(jié)果比較。A，背景見(jiàn)多量沉渣、清潔度較差，網(wǎng)狀纖維（黑箭頭）清晰度較差，網(wǎng)狀纖維與膠原纖維（紅箭頭）對(duì)比度差；B，背景見(jiàn)未見(jiàn)明顯沉渣、清潔度好，網(wǎng)狀纖維（黑箭頭）清晰度好，網(wǎng)狀纖維與膠原纖維（紅箭頭）對(duì)比度好，肝血竇內(nèi)皮下網(wǎng)狀纖維呈黑色，匯管區(qū)膠原纖維呈棕紅色；比例尺，100μmFig.1 Comparison of staining results between 2 groups. A, traditional staining method showed a lot of sediment and poor background cleanliness, low clarity of reticular fi ber, poor contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); B, improved new method showed no obvious sediment, cleaner background, higher clarity of reticular fi ber, good contrast between reticular fi ber (black arrow) and collagenous fi ber (red arrow); scale bar, 100μm

由于傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色方法存在諸多缺點(diǎn)，其主要原因如下：①高錳酸鉀是強(qiáng)氧化劑，0.25%高錳酸鉀水溶液氧化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)是染色過(guò)程易脫片的重要原因；②高錳酸鉀水溶液氧化后續(xù)的蒸餾水洗、草酸水溶液漂白、蒸餾水洗時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也是染色過(guò)程易脫片的原因；③2%硫酸鐵銨水溶液媒染后，自來(lái)水洗后再蒸餾水洗，蒸餾水沖洗不徹底時(shí)，自來(lái)水殘余的氯離子會(huì)與金屬銀反應(yīng)而導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維清晰度差、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度差，甚至導(dǎo)致脫片；④直接滴加Gomori氏氨銀溶液在切片上及其后的蒸餾水沖洗方法欠佳，導(dǎo)致切片背景銀顆粒沉渣多，也影響切片染色質(zhì)量；⑤10%甲醛溶液還原時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致脫片；⑥0.2%氯化金溶液調(diào)色過(guò)度導(dǎo)致網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳。針對(duì)傳統(tǒng)網(wǎng)狀纖維染色背景不清晰、染色過(guò)程易脫片、網(wǎng)狀纖維清晰度欠佳、網(wǎng)狀纖維與膠原纖維對(duì)比度欠佳等問(wèn)題，我們對(duì)傳統(tǒng)染色方法進(jìn)行了持續(xù)改進(jìn)，主要措施包括：調(diào)整部分染色步驟的作用時(shí)間；整個(gè)染色過(guò)程避免使用自來(lái)水沖洗；裁剪略大于組織的濾紙鋪于組織上，氨銀液染色步驟結(jié)束后不直接傾倒掉液體而是以蒸餾水直接沖洗；氨銀液染色后以蒸餾水速洗后即刻滴加10%甲醛溶液還原；由于蒸餾水洗有分化作用，時(shí)間應(yīng)控制好，否則易染色淺淡；以甲醛分析純?nèi)芤汉驼麴s水按1:9的比例配制10%甲醛溶液；氯化金調(diào)色步驟以肉眼觀組織由棕黃色變灰黑，再鏡下控制等等。其中較為關(guān)鍵的染色技巧是：裁剪略大于組織的濾紙鋪于組織上，再滴加氨銀液覆蓋濾紙表面10～15min，至濾紙表面形成一圈肉眼可見(jiàn)的銀顆粒為宜，如果銀顆粒不明顯，可適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間，用濾紙的效果是背景干凈無(wú)沉渣。

我們的實(shí)踐證明，改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色氨銀液配制方法、改進(jìn)網(wǎng)狀纖維染色方法，可提高氨銀液配制的成功率，延長(zhǎng)氨銀液有效期，提高網(wǎng)狀纖維的染色質(zhì)量，減少網(wǎng)狀纖維染色的脫片率。

[1] 聶艷紅，王紅霞，劉慧，等. 網(wǎng)狀纖維染色及P504S在胰腺實(shí)性假乳頭狀瘤鑒別診斷中的價(jià)值．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（7）：799-801.

[2] 孫志華. 基于JCI核心理念的ICU患者安全目標(biāo)持續(xù)改進(jìn)的護(hù)理實(shí)踐.中華現(xiàn)代護(hù)理雜志，2015，21（24）：2912-2915.

[3] 田媛媛，唐正利. 我院ICU多重耐藥菌感染管理實(shí)踐. 中華醫(yī)院管理雜志，2017，33（1）：56-57.

[4] 王德田，董建強(qiáng). 實(shí)用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù). 北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2013:91.