鼻黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及誘導(dǎo)分化

卓毅，吳沛，段答，葛麗特，王昊，龍浪，胡莉，盧明*

（1湖南師范大學(xué)第二附屬醫(yī)院，解放軍第163醫(yī)院神經(jīng)外科，長沙410003；2湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410006）

隨著對干細(xì)胞研究的不斷深入，神經(jīng)損傷的修復(fù)與再生已成為可能。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）不僅具有多向分化的潛能，還具有自我復(fù)制、造血支持以及免疫調(diào)節(jié)等功能[1,2]。目前研究比較廣泛的MSCs主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow MSCs, BM-MSCs），脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived MSCs, AD-MSCs）及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord MSCs, UC-MSCs）3種，但是這些細(xì)胞仍有倫理、免疫排斥等問題以及細(xì)胞來源不足等局限。

2010年有研究者在人鼻黏膜的嗅區(qū)中發(fā)現(xiàn)了嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(olfactory mucosa mesenchymal stem cells，OM-MSCs），因其屬于外胚層，也被稱為也稱為外胚間充質(zhì)干細(xì)胞[3]（ectomesenchymal stem cells，OE-MSC）。又因其解剖位置屬于固有層，所以也稱為固有層間充質(zhì)干細(xì)胞[4]（lamina propria mesenchymal stem cell，LP-MSCs）。OM-MSCs 易于獲取培養(yǎng)，廣泛分布于鼻內(nèi)[5]，不受年齡限制[6]，且具有多向分化的潛能；又因其安全性高，且無免疫排斥反應(yīng)，可用于自體移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)[7]。本研究則從SD大鼠鼻內(nèi)直接獲取鼻黏膜組織塊，在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增鼻黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（nasal mucosa mesenchymal stem cells，NMMSCs），并研究其細(xì)胞形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)特性及細(xì)胞周期等特性，旨在建立SD大鼠的NMMSCs培養(yǎng)體系，初步探討其生物學(xué)特性，為接下來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的動物實(shí)驗(yàn)研究提供更為優(yōu)越的種子細(xì)胞來源奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

高糖 DMEM-F12 培養(yǎng)基 (1 ∶ 1)（GIBCO 公司，美國）；10% FBS（HyClone 公司，澳大利亞）；雙抗（青霉素20 000 U/mL、鏈霉素 20000 ng/mL）；胰蛋白酶消化液；一抗CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD90、CD105（Sigma 公司，美國）；油紅O、茜草紅（GIBCO 公司，美國）；濕化CO2培養(yǎng)箱；流式細(xì)胞儀；倒置顯微鏡、免疫熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

2 NM-MSCs的取材和原代培養(yǎng)

成年 SD 大鼠，質(zhì)量 250～300g（中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心），經(jīng) 16%的水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉，消毒整個(gè)頭部毛發(fā)，并將毛發(fā)盡量剪除，再用絡(luò)合碘消毒皮膚，再將大鼠斷頸處死后將整個(gè)頭部離斷，然后在無菌條件下經(jīng)雙側(cè)鼻孔沿鼻腔向上至內(nèi)眥部剪開皮膚及鼻骨，顯露上、中、下鼻甲，用眼科剪剪下上、中、下鼻甲內(nèi)鼻黏膜置于 PBS 中，然后在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)分離全層鼻黏膜。鼻黏膜取出后用雙抗（青霉素200U/ml和鏈霉素200U/ml）漂洗3次去除血跡，再置于含10% FBS的DF-12培養(yǎng)基（含雙抗），用眼科剪充分剪碎，剪成0.5mm3組織塊，置于離心管中離心棄掉上清，最后將組織塊接種于用多聚賴氨酸（PLL）包被的培養(yǎng)瓶中，置于濕化培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，5% CO2） 進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊爬出來后進(jìn)行半量換液，以后每2～3d換液1次，當(dāng)細(xì)胞爬出較多時(shí)開始進(jìn)行傳代。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況、細(xì)胞形態(tài)并照相。

3 免疫熒光染色

對培養(yǎng)至第4代的NM-MSCs進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。步驟如下：取出6孔板內(nèi)鋪滿細(xì)胞的載玻片，先用PBS溶液清洗細(xì)胞載玻片3次，每次時(shí)間為5min；再將細(xì)胞進(jìn)行固定：固定液位4%多聚甲醛溶液15min即可；固定時(shí)間結(jié)束后首先沖洗掉固定液，兔抗Nestin (1:1000)、兔抗STRO-1(1:1000)放置于4℃的冰箱內(nèi)孵育過夜；次日從冰箱內(nèi)取出孵育好的載玻片，先用PBS平衡鹽溶液清洗一抗3次，每次5min即可；清洗完畢后再加入二抗（稀釋倍數(shù)為200倍），避光常溫下孵育1h，最后用PBS平衡鹽溶液洗掉二抗，每遍5min，洗3次；洗凈后最后便加入DAPI染細(xì)胞核，孵育時(shí)間為15min；最后用甲醇再清洗1次（因DAPI可以溶于甲醇），接著用抗熒光猝滅劑進(jìn)行最后的封片，置于熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。

4 NM-MSCs的細(xì)胞流式鑒定

取第4代NM-MSCs，PBS洗滌3次，0.25%胰蛋白酶37℃消化后，用含血清培養(yǎng)基終止消化，分為每管0.1ml。陰性對照管加鼠抗IgG-FITC、鼠抗IgG-PE抗體、鼠抗IgG-APC抗體；其他管分別加入兔抗鼠抗體CD19-FITC，CD31-APC，CD34-FITC，CD45-FITC，HLA-DR-PE，CD90-PE，CD105-PE，室溫孵育30min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

5 NM-MSCs體外定向誘導(dǎo)分化

選擇第4代NM-MSCs，按2.0×106/ml接種于用多PLL包被的無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長至細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，于各孔內(nèi)分別加入下列誘導(dǎo)劑：成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑油紅O （StemPro，Invitrogen，UK）和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑茜素紅（StemPro，Invitrogen，UK）。每2～ 3d換液1次，各組細(xì)胞誘導(dǎo)2周后，經(jīng)4%多聚甲醛固定15min，對誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染，對誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。

6 NM-MSCs細(xì)胞周期檢測

取第4代NM-MSCs，用胰蛋白酶消化5min，離心得細(xì)胞沉淀，PBS洗2～3次，制成單細(xì)胞懸液。加入1ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，800r/min離心5min，吸凈上清，加入400μl PBS，輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞分離為單個(gè)，逐滴加入預(yù)冷的100% 乙醇1.2 ml，使其終濃度為 75%，4℃放置過夜固定。取出固定的樣品，800r/min離心5min，棄上清。加入1ml預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，800r/min離心5min，離心收集細(xì)胞。重復(fù)1～2次，去除乙醇加入150μl（碘化丙啶）PI工作液，4℃避光染色30min。轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機(jī)檢測，排除粘連細(xì)胞和碎片后分析PI熒光直方圖上各細(xì)胞周期的百分率。

結(jié) 果

1 NM-MSCs的形態(tài)特征

NM-MSCs廣泛分布于鼻腔中，上、中、下鼻甲均有分布，組織塊取自上、中、下鼻甲的鼻黏膜（圖1 A），然后在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)分離全層鼻黏膜（圖1 B）。采用組織貼壁法培養(yǎng)NM-MSCs，組織塊多于1d內(nèi)即可貼壁，3d后可見大部分組織塊開始有細(xì)胞爬出，此時(shí)以雜質(zhì)細(xì)胞居多；隨著時(shí)間延長，從組織塊爬出的細(xì)胞面積越來越大，至第8d即可進(jìn)行細(xì)胞傳代（圖2 A-E）。傳代后的細(xì)胞生長速度明顯加快，約2～3d可傳代1次，傳代至第4代時(shí)細(xì)胞多呈梭形與多角形態(tài)，整體細(xì)胞形態(tài)以平行排列生長為主，且呈漩渦狀生長（圖2 F）。

圖 1 SD大鼠鼻黏膜組織塊獲取。A，鼻腔內(nèi)上、中、下鼻甲內(nèi)鼻黏膜；B，光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)分離全層鼻黏膜Fig. 1 Collection of nasal mucosa from SD rats. A, nasal mucosa of the upper, middle and lower turbinate of SD rat nasal cavity; B, separation of complete nasal mucosa under light microscope.

圖 2 培養(yǎng)不同時(shí)間的NM-MSCs光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征。比例尺，100μmFig. 2 Morphological features of NM-MSCs in culture at different time. Scale bar, 100μm

2 NM-MSCs標(biāo)志物

對培養(yǎng)至第4代的NM-MSCs進(jìn)行免疫熒光染色鑒定顯示，NM-MSCs不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物STRO-1（圖3 A），還可以同時(shí)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin（圖3 B）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示：NM-MSCs不表達(dá)CD19、CD31、CD34、CD45及HLA-DR細(xì)胞表面標(biāo)記物，但表達(dá)CD90、CD105等基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（圖4）。

圖 4 第四代NM-MSCs表面標(biāo)志物表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測Fig. 4 Flow cytometry detection of surface marker expression in osteogenic or adipogenic induced NM-MSCs at passage 4

圖 3 第四代NM-MSCs標(biāo)志物的免疫熒光染色鑒定。A，STRO-1染色；B，nestin染色；比例尺，100μmFig. 3 Identi fi cation of NM-MSCs markers by immuno fl uorescence staining. A, STRO-1; B, nestin; scale bar, 100μm

3 第4代NM-MSCs體外成骨成脂誘導(dǎo)分化

第4代的NM-MSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞表面可見茜素紅染色陽性的鈣結(jié)節(jié)沉積，說明NM-MSCs在體外具有向成骨細(xì)胞分化的潛能(圖5A)；第4代的NM-MSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3周后，經(jīng)油紅O染色，可見油紅O染色陽性的脂滴形成，說明NM-MSCs在體外有向脂肪組織分化的潛能 (圖 5B) 。

圖5 第4代NM-MSCs成骨（A）成脂（B）誘導(dǎo)分化后茜素紅（A）及油紅O (B) 染色。A，茜素紅染色后細(xì)胞間礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色；B，油紅O染色可見細(xì)胞間有紅色顆粒形成；比例尺，100μmFig. 5 Oil red O and Alizarin red staining for NM-MSCs at 3 weeks after induction. A, the mineralized nodules of the cells were alizarin red staining positive; B, positive oil red O staining indicates the formation of lipid particles between cells; scale bar, 100μm

4 第4代NM-MSCs的細(xì)胞周期

對第4代SD大鼠NM-MSCs的細(xì)胞周期進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示， 57.96%處于G1期，G2期占28.26%，而S期僅占13.78%。結(jié)果提示NM-MSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)下的細(xì)胞占了大部分，小部分處于復(fù)制期，仍保留了細(xì)胞的更新、增殖能力，符合干細(xì)胞的生長特性（圖6）。

圖6 第4代NM-MSCs的細(xì)胞周期分析Fig. 6 Cell cycle analysis of NM-MSCs at the 4th passage

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種在機(jī)體分布極為廣泛的成體干細(xì)胞，具有迅速增殖及多向分化的潛能[8,9]。它既可以分化為脂肪組織、骨組織等中胚層的組織細(xì)胞，也被證實(shí)能夠向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等外胚層的細(xì)胞分化[10]。NM-MSCs在鼻腔內(nèi)分布比較廣泛，于鼻中隔、上、中、下鼻甲的黏膜內(nèi)均有分布[11]。而中胚層來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等雖具有向各類中胚層組織結(jié)構(gòu)分化的趨勢，但它們在體外培養(yǎng)過程中向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化的能力較弱，因?yàn)榇诉^程需要跨胚層來完成[12]。而NM-MSCs存在于鼻黏膜的固有層內(nèi)，來源于外胚層，其不僅可分化為中胚層來源的組織，還可以無需跨胚層分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[13,14]。目前，尋找更好來源的種子細(xì)胞仍是神經(jīng)損傷修復(fù)與組織細(xì)胞工程研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，也是今后大量動物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)及突破口。

本實(shí)驗(yàn)便將鼻黏膜通過組織塊貼壁法進(jìn)行體外培養(yǎng)、純化及擴(kuò)增NM-MSCs。用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行的鼻黏膜組織塊貼壁法培養(yǎng)NM-MSCs，經(jīng)換液、傳代去除雜細(xì)胞，傳至第4代時(shí)便可獲得較高純度的NM-MSCs，且此時(shí)細(xì)胞形態(tài)絕大部分為梭形，少部分成多角形狀，整體細(xì)胞貼壁呈現(xiàn)出旋渦狀或平行排列生長。我們?yōu)榱俗C實(shí)NM-MSCs與其他來源的MSCs不同之處，對其進(jìn)行了MSCs標(biāo)記物STRO-1和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物nestin的免疫熒光染色檢測，結(jié)果顯示兩者均顯著表達(dá)。再用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不表達(dá)CD19、CD31、CD34、CD45及HLA-DR細(xì)胞表面標(biāo)記物，而表達(dá)CD90、CD105等基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，符合MSCs的細(xì)胞流式檢測的特性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NM-MSCs的多向分化的潛能，我們分別對其進(jìn)行誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞及脂肪組織定向分化，結(jié)果顯示：在成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，NM-MSCs在細(xì)胞表面可見茜素紅染色陽性的鈣結(jié)節(jié)沉積；用脂肪誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，也可見油紅O染色陽性的脂滴形成。上述結(jié)果表明通過組織塊貼壁法培養(yǎng)出來的NM-MSCs具有MSCs的一般細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表型和多向分化的潛能。第4代SD大鼠NM-MSCs的細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示：57.96%處于G1期，G2期占28.26%，而S期僅占13.78%，提示NM-MSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)下的細(xì)胞占了大部分，小部分處于復(fù)制期，但仍保留了細(xì)胞的更新、增殖能力，符合干細(xì)胞的生長特性。

本實(shí)驗(yàn)通過對鼻黏膜進(jìn)行組織塊貼壁法建立了一種能有效地富集純度很高的NM-MSCs培養(yǎng)體系，并通過細(xì)胞免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面抗原，且不表達(dá)造血干細(xì)胞特異性抗原，再將其誘導(dǎo)分化成了成骨細(xì)胞及脂肪組織，最后對其進(jìn)行了細(xì)胞周期檢測與分析。證實(shí)了該培養(yǎng)體系培養(yǎng)的細(xì)胞為純度高、擴(kuò)增能力強(qiáng)且數(shù)量充足的NM-MSCs，為接下來我們大量的動物實(shí)驗(yàn)研究及組織細(xì)胞工程提供了更為優(yōu)越的種子細(xì)胞來源。

[1] Fayyad-Kazan H, Faour WH, Badran B, et al. The immunomodulatory properties of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells are de fi ned according to multiple immunobiological criteria. In fl amm Res, 2016, 65(6): 501-510.

[2] Ge L, Jiang M, Duan D, et al. Secretome of Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cell, a Multiple Potential Stem Cell.Stem Cells Int, 2016, 2016: 1243659.

[3] Delorme B, Nivet E, Gaillard J, et al. The human nose harbors a niche of olfactory ectomesenchymal stem cells displaying neurogenic and osteogenic properties. Stem Cells Dev, 2010, 19(6): 853-866.

[4] Lindsay SL, Johnstone SA, Mountford JC, et al. Human mesenchymal stem cells isolated from olfactory biopsies but not bone enhance CNS myelination in vitro. Glia, 2013,61(3): 368-382.

[5] Hwang SH, Park SH, Choi J, et al. Characteristics of mesenchymal stem cells originating from the bilateral inferior turbinate in humans with nasal septal deviation. PLoS One,2014, 9(6): e100219.

[6] Hwang SH, Park SH, Choi J, et al. Age-related characteristics of multipotent human nasal inferior turbinate-derived mesenchymal stem cells. PLoS One, 2013, 8(9): e74330.

[7] Feron F, Perry C, Girard SD, et al. Isolation of adult stem cells from the human olfactory mucosa.MethodsMol Biol,2013, 1059: 107-114.

[8] Tanna T, Sachan V. Mesenchymal stem cells: potential in treatment of neurodegenerative diseases. Curr Stem Cell Res Ther, 2014, 9(6): 513-521.

[9] Pal R, Gopinath C, Rao NM, et al. Functional recovery after transplantation of bone marrow-derived human mesenchymal stromal cells in a rat model of spinal cord injury. Cytotherapy, 2010, 12(6): 792-806.

[10] 葛麗特，卓毅，段答，等. 人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，40（01）：53-58.

[11] Bas E, Van De Water TR, Lumbreras V, et al. Adult human nasal mesenchymal-like stem cells restore cochlear spiral ganglion neurons after experimental lesion. Stem Cells Dev,2014, 23(5): 502-514.

[12] Wagner W, Wein F, Seckinger A, et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp Hematol,2005, 33(11): 1402-1416.

[13] 黃秋生，陸漢強(qiáng)，周月鵬，等. 成人鼻黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和多向誘導(dǎo)分化. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，11：490-493，498.

[14] Lindsay SL, Riddell JS, Barnett SC. Olfactory mucosa for transplant-mediated repair: a complex tissue for a complex injury. Glia, 2010, 58(2): 125-134.

[15] Parekkadan B, Milwid JM. Mesenchymal stem cells as therapeutics. Annu Rev Biomed Eng, 2010, 12: 87-117.

[16] Lee PH, Kim JW, Bang OY, et al. Autologous mesenchymal stem cell therapy delays the progression of neurological de fi cits in patients with multiple system atrophy. Clin Pharmacol Ther, 2008, 83(5): 723-730.

[17] Tavakoli F, Ostad SN, Khori V, et al. Outcome improvement of cellular cardiomyoplasty using triple therapy: mesenchymal stem cell +erythropoietin+vascular endothelial growth factor. Eur J Pharmacol, 2013, 714(1-3): 456-463.

[18] Zemel’ko VI, Kozhukharova IV, Kovaleva ZV, et al. BDNF secretion in human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow, endometrium and adipose tissue. Tsitologiia,2014, 56(3): 204-211.

[19] Himes BT, Neuhuber B, Coleman C, et al. Recovery of function following grafting of human bone marrow-derived stromal cells into the injured spinal cord. Neurorehabil Neural Repair, 2006, 20(2): 278-296.