IL-32α抑制胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制研究

李冰震　王理富　吳文元　陳景鋒

IL-32是一種促炎細(xì)胞因子，包含6種主要的亞型（IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ），其中最主要的為IL-32α[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，不同亞型的IL-32在炎癥性腸病、腫瘤、自身免疫病等中扮演不同的角色，在細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長、增強(qiáng)炎癥反應(yīng)以及促進(jìn)血管生成等過程中發(fā)揮不同的生理作用[3-5]。胰腺上皮細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與胰腺腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其中鈣黏附蛋白E（E-cadherin）的表達(dá)下調(diào)以及某些間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[如波形蛋白（Vimentin）、E盒結(jié)合鋅指蛋白1（Zeb1）]表達(dá)上調(diào)被認(rèn)為是EMT過程的標(biāo)志[6-7]；金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs）可降解細(xì)胞基膜和外基質(zhì)，與金屬基質(zhì)蛋白酶抑制物（TIMPs）保持動(dòng)態(tài)平衡，在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中同樣起重要作用[8]。Janus激酶（Jak）及其下游通路蛋白細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）可調(diào)節(jié)功能基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等；Jak/STAT3信號通路參與調(diào)控胰腺癌EMT過程[9-10]?；诖?，本研究將不同濃度的IL-32α作用于人胰腺癌細(xì)胞Panc-1、AsPC-1，檢測胰腺癌細(xì)胞的EMT、侵襲轉(zhuǎn)移及Jak2/STAT3信號通路的改變，探討其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1材料人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1、AsPC-1購自上海生命科學(xué)研究所；重組人IL-32α購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；STAT3、p-STAT3、Jak2、p-Jak2、E-cadherin、Vimentin、Zeb1、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司；Trizol細(xì)胞裂解液購自美國Invitrogen公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；SYBR green RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自美國Thermo公司；蛋白濃度試劑盒購自廣州白云天公司；7500熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；熒光顯微鏡（DM4000M）購自德國徠卡公司；自動(dòng)曝光機(jī)（Image QuantTM400）購自德國Rawak Software公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將Panc-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中；人胰腺癌細(xì)胞AsPC-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的1640培養(yǎng)基中；兩者均置于37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代。在Panc-1及AsPC-1細(xì)胞株中分別添加不同濃度的IL-32α后分為0μg/ml組（空白對照組）、10μg/ml組、25μg/ml組、50μg/ml組。

1.2.2RT-PCR檢測Vimentin、CDH1、Zeb1、MMP-2及MMP-9的mRNA表達(dá)水平采用Trizol細(xì)胞裂解液提取上述4組Panc-1、AsPC-1細(xì)胞總RNA；分光光度計(jì)檢測所提取RNA的純度及濃度；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBR green RT-PCR反應(yīng)試劑盒與不同的引物（引物序列詳見表1）在7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行目標(biāo)片段擴(kuò)增；反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 10min）×1個(gè)循環(huán)（95°C 15s）×40個(gè)循環(huán)（62°C 60s）×40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1　引物序列

1.2.3Western blot檢測E-cadherin、Vimention、Zeb1、MMP-2、MMP-9蛋白及Jak2/STAT3信號通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3、STAT3表達(dá)水平用含有PMSF和磷酸酶抑制劑的RAPI裂解液（裂解液：PMSF：磷酸酶抑制劑=1 000∶10∶100）充分裂解上述4組Panc-1和AsPC-1細(xì)胞，提取總蛋白；并檢測濃度；根據(jù)不同的蛋白濃度配比不同量PBS，加入4μl 5×SDS上樣緩沖液配制成濃度相同總量為20μl的上樣液；變性（100°C 5min）后加在5%濃縮膠及不同濃度的分離膠（8%～12%）中電泳，先以55V恒壓進(jìn)行，至濃縮膠和分離膠交界線處（通常至Marker條帶顯現(xiàn)）轉(zhuǎn)換電壓為110V。恒流轉(zhuǎn)膜，電流為350mA，時(shí)間根據(jù)每個(gè)目的蛋白的分子量不同而異。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入5ml 5%脫脂奶粉液中封閉1～2h，棄去封閉液，1×TBST洗膜（3次，5min/次）；將膜置于載玻片上，用一抗4°C下孵育過夜，1×TBST液洗膜（3次，5min/次），再置于二抗液（1∶5 000）中室溫?fù)u床低速孵育1～2h，棄去二抗液，1×TBST液洗膜（3次，5 min/次）。用image lab自動(dòng)曝光機(jī)檢測相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶，分析條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測Vimentin蛋白表達(dá)將無菌黏附蓋玻片置于6孔板中，每張玻片上滴25ug/ml的多聚賴氨酸1ml，室溫下過夜。取上述4組對數(shù)生長期細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液種植在黏附蓋玻片上，培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8h，待細(xì)胞貼壁且生長至70%～80%后，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含不同濃度IL-32α的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。棄去培養(yǎng)液洗滌后每孔加4%多聚甲醛1ml，室溫固定10min后棄去，PBS清洗。加入0.3%Triton-100 1ml，室溫孵育10min后棄去，PBS清洗。加入適量5%山羊血清室溫封閉30min后棄去，將蓋玻片覆蓋于一抗液上，置于一抗孵育濕盒內(nèi)4℃過夜，次日將蓋玻片重新置于6孔板中，PBS清洗；避光二抗孵育(37℃60min)，PBS清洗；每孔滴加5μg/ml DAPI 1滴并將黏附蓋玻片蓋上，細(xì)胞核染色（37℃3min），PBS清洗；每孔滴加1滴抗熒光淬滅封片。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并選定位置分別拍細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色照。

1.3觀察指標(biāo)觀察不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞EMT、侵襲轉(zhuǎn)移、Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結(jié)果。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞EMT的抑制結(jié)果見圖1。

圖1　不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞EMT的抑制結(jié)果（a、b：Vimentin、CDH1、Zeb1 mRNA表達(dá)水平比較；c、d：E-cadherin、Vimentin、Zeb1蛋白表達(dá)水平比較，內(nèi)參蛋白為GAPDH；e、f：Vimentin蛋白免疫熒光染色強(qiáng)度比較；與0μg/ml組比較，*P＜0.05；與10μg/ml組比較，#P＜0.05；與25μg/ml組比較，△P＜0.05）

由圖1 a、b可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞EMT相關(guān)分子標(biāo)志物上皮樣標(biāo)志物E-cadherin的mRNA CDH1表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性上調(diào)（均P＜0.05)，而細(xì)胞間質(zhì)樣標(biāo)志物Vimentin、Zeb1的mRNA表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05)。

由圖1 c、d可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞E-cadherin的蛋白表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性上調(diào)（均P＜0.05），而Valentin、Zeb1的蛋白表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05）。

由圖1 e、f可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，免疫熒光染色強(qiáng)度呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05）。

2.2不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制結(jié)果見圖2。

圖2　不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制結(jié)果（a、b：MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較；c、d：MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較，內(nèi)參蛋白為GAPDH；與0μg/ml組比較，*P＜0.05；10μg/ml組比較，#P＜0.05；與25μg/ml組比較，△P＜0.05）

由圖2a、b可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞中MMP2 mRNA均呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05），胰腺癌AsPC-1細(xì)胞中MMP9 mRNA呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05）。

由圖2c、d可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05）。

2.3不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結(jié)果見圖3。

圖3　不同濃度IL-32α對胰腺癌細(xì)胞Jak2/STAT3信號通路蛋白的抑制結(jié)果（內(nèi)參蛋白為GAPDH）

由圖3可見，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞中Jak2/STAT3信號通路蛋白p-Jak2、Jak2、p-STAT3的表達(dá)水平均呈IL-32α劑量依賴性下調(diào)（均P＜0.05），STAT3的表達(dá)水平不受IL-32α濃度的影響（P＞0.05）。

3　討論

胰腺癌的高度侵襲性通常被認(rèn)為是患者預(yù)后極差的重要原因之一。EMT是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中重要的生物學(xué)過程；它迫使最初的腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力從而轉(zhuǎn)移至腫瘤邊緣，或者通過血液、淋巴液等其他媒介轉(zhuǎn)移至人體的其他部位形成新的腫瘤灶[11]。EMT與胰腺癌患者淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、門靜脈的癌栓形成以及患者的長期生存率有顯著的相關(guān)性[12]。逆轉(zhuǎn)EMT正成為越來越重要的臨床治療胰腺癌的目標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，IL-32α不但可以從基因?qū)用嫔洗龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄因子CDH1，抑制轉(zhuǎn)錄因子Vimentin和Zeb1；還可從蛋白層面上促進(jìn)E-cadherin蛋白的表達(dá)，抑制Vimentin和Zeb1蛋白的分泌。MMPs是一系列家族性肽鏈內(nèi)切酶，在EMT過程中具有降解細(xì)胞基底膜的蛋白水解活性。MMPs在胰腺癌中已被證明具有增加細(xì)胞侵襲性，促進(jìn)血管生成以及誘發(fā)藥物抗性等作用；有研究認(rèn)為其在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中是另一種重要的監(jiān)控分子[13-14]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞分泌高水平的MMP-2和MMP-9；且RT-PCR結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9的mR-NA可被IL-32α抑制，Western blot結(jié)果也顯示IL-32α可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的分泌。但是，值得注意的一個(gè)現(xiàn)象是IL-32α抑制MMPs蛋白程度要遠(yuǎn)大于抑制mRNA程度，這提示IL-32α抑制胰腺癌細(xì)胞MMPs蛋白的表達(dá)可能是通過抑制基因的轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)。綜上，筆者認(rèn)為IL-32α可通過影響蛋白水解酶的激活以及黏附能力來部分抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。這些發(fā)現(xiàn)反映了IL-32α影響胰腺癌生物學(xué)屬性的潛在可能，當(dāng)然，這需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)論證。

關(guān)于IL-32對腫瘤細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的影響，許多學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)。一些研究者認(rèn)為異常分泌的IL-32β可通過調(diào)節(jié)VEGF-STAT3信號通路來刺激腫瘤細(xì)胞的遷移[3]。也有研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞中IL-32可通過激活NF-κB增強(qiáng)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，這些觀點(diǎn)與本研究的結(jié)論有所矛盾[4]。筆者認(rèn)為不同類型的腫瘤表達(dá)不同類型和數(shù)量的IL-32受體，這可以部分解釋不同亞型的IL-32對各種腫瘤細(xì)胞所造成的差異影響。這提示，不同濃度的IL-32α是影響腫瘤細(xì)胞相關(guān)的生物學(xué)性能的另一個(gè)因素。此外，Jak2/STAT3通路被認(rèn)為在胰腺炎誘導(dǎo)的Kras-依賴的胰腺癌腫形成中占有重要的地位[15]。本研究結(jié)果顯示Jak2/STAT3信號通路可以被IL-32α抑制；這間接表明IL-32α類似AG490（Jak2的特異性抑制劑）具有潛在抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，甚至存在逆轉(zhuǎn)慢性胰腺炎誘導(dǎo)胰腺癌的可能。重要的是，本研究中還發(fā)現(xiàn)胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞都可自發(fā)的分泌高水平p-STAT3；雖然這并不是公認(rèn)的典型與EMT相聯(lián)系的途徑，有研究證實(shí)STAT3通過相關(guān)機(jī)制改變轉(zhuǎn)錄因子Zeb1來影響腫瘤細(xì)胞的EMT[16]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞中Zeb1表達(dá)水平隨著p-STAT3的增多而顯著上升。因此，胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞中自發(fā)分泌的高水平p-STAT3被IL-32α顯著抑制可以認(rèn)為是其抑制胰腺癌EMT與侵襲轉(zhuǎn)移的一種重要機(jī)制；高水平的p-STAT3可能在維持EMT特性和胰腺癌細(xì)胞的侵襲性中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)然，不排除其他可能存在的IL-32α抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。

綜上所述，胰腺癌具有高度侵襲性和低生存率的特性，本研究結(jié)果表明，IL-32α在一定劑量范圍內(nèi)以劑量依賴性的方式抑制胰腺癌Panc-1、AsPC-1細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移。IL-32α對于胰腺癌的精準(zhǔn)治療有潛在的臨床運(yùn)用前景。相比傳統(tǒng)化療藥物，IL-32α作為一種內(nèi)源性細(xì)胞因子具有無免疫原性以及低細(xì)胞毒性等優(yōu)勢，患者可在一定程度上減輕傳統(tǒng)化療藥物所引起的諸多不良反應(yīng)；但這些生物學(xué)功能均需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究。IL-32α及Jak2/STAT3信號通路或可作為潛在的藥理干預(yù)胰腺癌進(jìn)展的分子靶點(diǎn)。

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