miRNAs調(diào)控成肌分化及其在肌肉減少癥中的分子機(jī)制

余博飛(綜述), 李貞鵬, 徐 杰(審校)

肌肉減少癥最早于1989年由Rosenberg提出，用來描述隨著年齡增加而出現(xiàn)的骨骼肌質(zhì)量減少和肌力減退，并伴隨機(jī)體功能下降進(jìn)而導(dǎo)致跌倒、殘疾等不良事件為特征的疾病[1]。隨著我國(guó)人口老齡化加劇，肌肉減少癥變得日益常見，它不僅容易導(dǎo)致老年群體摔跤、骨折和機(jī)體失能，同時(shí)還顯著增加罹患糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，影響老年人生活質(zhì)量，給家庭、社會(huì)及醫(yī)療服務(wù)系統(tǒng)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。microRNAs(miRNAs)是一大類廣泛存在于真核細(xì)胞中的參與基因調(diào)控的小分子RNA，在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及損傷后的再生修復(fù)過程中，miRNAs的異常表達(dá)與之關(guān)系尤為密切。本研究將對(duì) miRNAs 參與調(diào)控骨骼肌分化及其在肌肉減少癥防治方面的作用機(jī)制做一綜述，旨在為確立miRNAs作為肌肉減少癥治療的潛在靶點(diǎn)提供新思路和新方向。

1 miRNA的概述和骨骼肌的發(fā)育分化

miRNA是長(zhǎng)度約為20～25 bp的高度保守的小分子RNA，廣泛存在于真核生物中[3]。通過與其靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)特異性結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯或者使其降解，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)。近年來，大量的研究表明，miRNAs對(duì)骨骼肌生理發(fā)揮重要作用，許多miRNAs被證實(shí)參與調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育和再生修復(fù)過程，并且在一些骨骼肌疾病中也檢測(cè)到了異常表達(dá)的miRNAs[4]。通常把在骨骼肌或者心肌組織中高富集表達(dá)的miRNAs稱為肌肉組織特異性miRNA(myomiRNA)，經(jīng)典的myomiRNA包括miRNA-1，miRNA-133及miRNA-206[5]。

骨骼肌的形成是個(gè)十分復(fù)雜的過程，包括骨骼肌的干細(xì)胞即衛(wèi)星細(xì)胞激活后形成成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞增殖到一定數(shù)量后退出細(xì)胞周期、分化形成多核肌管，多核肌管進(jìn)一步成熟，進(jìn)而形成具有特定功能的肌纖維。這一復(fù)雜過程的進(jìn)行受到許多成肌分化因子的精密調(diào)控，目前公認(rèn)的有成肌調(diào)節(jié)因子家族，包括生肌因子(myogenic factor 5,myf5)、成肌分化因子(myogenic differentiation, MyoD)、成肌調(diào)控因子4(myogenic regulatory factor 4,mrf4)和肌細(xì)胞生成素(myogenin, MyoG)，其中MyoD是成肌程序啟動(dòng)的決定因子。另一類參與成肌分化的調(diào)控因子是Pax轉(zhuǎn)錄因子家族，主要包括Pax3和Pax7，這二者主要負(fù)向調(diào)控MyoD的表達(dá)，這對(duì)于維持骨骼肌干細(xì)胞的狀態(tài)至關(guān)重要。一旦啟動(dòng)成肌決定，衛(wèi)星細(xì)胞激活，Pax3和Pax7表達(dá)立即減少，成肌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加。

2 miRNAs參與成肌分化的調(diào)控作用

2.1肌肉特異性miRNAs在骨骼肌分化中的調(diào)控作用 前已述及，經(jīng)典的MyomiRNA有miR-1,miR-206,miR-133，其中miR-1和miR-133在心肌和骨骼肌中均有表達(dá)，而miR-206只特異性表達(dá)在骨骼肌中。miR-1通過抑制組蛋白去乙?；?4(histone deacetylase，HDAC4)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化，HDAC4是成肌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制物，通過抑制肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C,MEF2C)來發(fā)揮作用[6-7]，此外，miRNA-1抑制HDAC4表達(dá)后會(huì)產(chǎn)生卵泡抑素，后者能加速肌管融合從而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[8]。Kukreti等還發(fā)現(xiàn)，miRNA-1參與高劑量的地塞米松誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮[9]，其機(jī)制是miRNA-1下調(diào)具有保護(hù)性的熱休克蛋白70的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)FOXO3，MuRF-1及Atrogin-1這三個(gè)萎縮信號(hào)。miR-133a 一方面可以通過抑制血清反應(yīng)因子促進(jìn)肌細(xì)胞增殖[7]，另一方面又可以參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的重要通路——IGF信號(hào)通路。研究表明，miRNA-133可以靶向胰島素生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)，在C2C12細(xì)胞中過表達(dá)miR-133，IGF-1R的表達(dá)被顯著抑制[10]，而 MyoG的表達(dá)明顯升高。此外，最近一項(xiàng)在C2C12成肌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)表明，miRNA-133a還可以抑制Foxl2的表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[11]，但其如何通過抑制Foxl2表達(dá)影響成肌分化仍有待進(jìn)一步研究。DNA結(jié)合受體抑制因子( inhibitor of DNA binding，Id)是成肌轉(zhuǎn)錄因子MyoD的抑制因子，早期已有研究表明，miRNA-206通過直接下調(diào)Id表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成肌分化[12]，此外還可與miRNA-486 發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，通過與Pax7的 3'-UTR結(jié)合，抑制DNA結(jié)合受體抑制因子2(Id2)的蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成肌分化[13]。最近的研究表明，MyoD促進(jìn)成肌分化是通過誘導(dǎo)產(chǎn)生miRNA-206，之后miRNA-206靶向抑制Twist-1的表達(dá)來促進(jìn)成肌分化[14]。

借助于基因芯片技術(shù)，近年來又發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)在肌肉組織中表達(dá)豐富的myomiRNA， miRNA-208和miRNA-499通過肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC)亞型參與調(diào)節(jié)肌纖維類型，肌纖維可分為Ⅰ型(慢)和Ⅱ型(快)肌纖維，其中Ⅱ型纖維又進(jìn)一步分為Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx，其主要差異是MHC亞型組成的不同。miR-208b和 miR-499可激活慢肌特異基因并抑制快肌基因表達(dá)來調(diào)控肌纖維類型的轉(zhuǎn)換。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá) miR-499引起比目魚肌中快肌完全轉(zhuǎn)化為慢肌。相反，聯(lián)合敲除小鼠 miR-499和 miR-208b則會(huì)導(dǎo)致比目魚肌慢肌纖維的顯著丟失[15]。

2.2肌肉非特異性miRNAs在骨骼肌分化中的調(diào)控作用 近幾年，一些肌肉非特異性miRNAs被相繼發(fā)現(xiàn)在成肌分化過程中參與調(diào)控，有些通過作用于成肌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如miR-186通過靶向MyoG，起到抑制肌肉終末分化的作用[16]。MyoD是成肌過程啟動(dòng)的決定因子，高水平的MyoD能誘導(dǎo)myomiRNA表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-221/222的過表達(dá)或者敲除可分別導(dǎo)致MyoD蛋白表達(dá)下調(diào)或者上調(diào)，進(jìn)而引發(fā)其下游myomiRNA表達(dá)的抑制或者增強(qiáng)[17]。Togliatto等在構(gòu)建下肢骨骼肌缺血損傷后再生的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，去乙?；奈葛囸I素能誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧化物歧化酶-2(SOD-2)來抵抗活性氧物質(zhì)造成的細(xì)胞損傷[18]，巧合的是，此作用也要依賴于SOD-2誘導(dǎo)表達(dá)的miRNA221/222。Dai等發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)參與調(diào)節(jié)MyoD活性的miRNA-128[19]。熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，其靶向mRNA是SP1，而SP1是MyoD的激活物和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(CDKN1A，P21)的抑制物，后者可抑制細(xì)胞增殖，是一個(gè)腫瘤抑制基因。實(shí)驗(yàn)表明，高表達(dá)的miRNA-128通過結(jié)合SP1抑制衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化。有趣的是，抑制miRNA-128表達(dá)后，衛(wèi)星細(xì)胞分化增強(qiáng)但增殖依然被抑制，這可能是由于SP1水平升高及MyoD表達(dá)增強(qiáng)后使細(xì)胞加速退出細(xì)胞周期所致。不僅如此，該研究小組還發(fā)現(xiàn)了miRNA-143通過作用于IGF信號(hào)通路上的一個(gè)重要信號(hào)分子——IGFBP5，從而增強(qiáng)IGF信號(hào)通路起到促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的作用[20]。

miRNAs不僅可以對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，還能參與調(diào)節(jié)基因的時(shí)空表達(dá)模式。選擇性剪接是基因的一種表現(xiàn)形式，通過將同一基因中的外顯子以不同的組合方式來實(shí)現(xiàn)，使一個(gè)基因的表達(dá)具有時(shí)空性。RNA結(jié)合蛋白R(shí)bm24是肌肉特異性選擇性剪接的主要調(diào)控者，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA-222可以靶向Rbm24從而在選擇性剪接水平調(diào)控成肌分化[21]。肌形成過程除了需要特定轉(zhuǎn)錄因子外，科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)了一些與成肌分化相關(guān)的特定功能蛋白。最近，Luo等在小鼠肌肉里找到一種被稱為成肌蛋白的跨膜蛋白，該蛋白對(duì)肌管融合至關(guān)重要，通過RNA干擾技術(shù)敲除成肌蛋白基因后[22]，成肌細(xì)胞的融合被顯著抑制。他們還發(fā)現(xiàn)，在體外miRNA-140-3p能與成肌蛋白基因的3′-UTR結(jié)合從而抑制成肌細(xì)胞融合。

miRNA對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控也能影響成肌分化過程。TGF-β-Smads是一條負(fù)向調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)和再生的重要信號(hào)通路，目前已發(fā)現(xiàn)了多種能調(diào)節(jié)Smads蛋白水平的miRNAs。MiRNA-26a通過抑制Smad-1和Smad-4的表達(dá)促進(jìn)成肌分化[23]，而miR-675-3p是抑制Smad1和 Smad5[24]，miRNA-146b的靶向mRNA包括Smad4，Notch1及Hmga2[25]，miRNA-431是最近才被確認(rèn)的能夠通過靶向 Smad4促進(jìn)成肌分化[26]。肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin，MSTN)屬于TGF-β家族，又被稱為生長(zhǎng)分化因子8，通過抑制IGF-Akt及Wnt信號(hào)途徑等來強(qiáng)力抑制肌細(xì)胞增殖分化。近來已證實(shí)，miRNA-27a/b通過靶向MSTN促進(jìn)成肌分化[27]。Wnt信號(hào)通路在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中的作用很早以前就得到確認(rèn)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-199-5a通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的蛋白水平，共同調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞增殖和分化[28]。因此，在營(yíng)養(yǎng)不良肌肉中過表達(dá) miRNA-199-5a會(huì)阻礙信號(hào)通路，進(jìn)而阻礙成肌分化與再生。與此相反，miRNA-145-5P發(fā)揮正向調(diào)節(jié)的作用，通過結(jié)合Wnt信號(hào)通路上的一些特殊基因，包括Wnt5a，LRP5，Axin2及β-catenin[29]。

3 miRNAs與肌肉減少癥

肌肉減少癥是隨著年齡增加而進(jìn)展的肌肉代謝失衡性疾病，表現(xiàn)為骨骼肌蛋白質(zhì)合成減少和分解增加，除了骨骼肌蛋白代謝紊亂外，近年來對(duì)骨骼肌干細(xì)胞的相關(guān)研究報(bào)道也越來越多，研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體衰老過程中骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞存在明顯的功能障礙，表現(xiàn)為自我更新能力喪失、再生能力減退等[30-32]，這些都與骨骼肌萎縮的發(fā)生密切相關(guān)。

借助于全基因組miRNA分析技術(shù)，Kim等在成年小鼠與衰老小鼠腓腸肌組織的對(duì)比表達(dá)分析中，檢測(cè)到34個(gè)差異表達(dá)的miRNAs[33]，表達(dá)上調(diào)的miRNAs中miRNA-206，miRNA-34a，miRNA-146，miRNA-155和表達(dá)下調(diào)中的miRNA-143，miRNA-148在既往研究中均有報(bào)道。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，這些miRNAs中有8個(gè)是以成簇的形式存在于小鼠12號(hào)染色體上的Dlk1-Dio3印記區(qū)，而此印記區(qū)在小鼠骨骼肌發(fā)育過程中具有調(diào)節(jié)作用。Shin等發(fā)現(xiàn)，膜結(jié)合型的Dlk1能促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞的肌向分化[34]，而水溶性的Dlk1作用正好相反。此外，通過RNA測(cè)序，Mercken等在獼猴身上的研究也發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNA[35]，其中miRNA-451，miRNA-144，miRNA-18a及miRNA-15a等表達(dá)上調(diào)，miRNA-181a和miRNA-181b等表達(dá)下調(diào)，并且在熱量限制(caloric restriction，CR)的實(shí)驗(yàn)組與正常能量攝入的對(duì)照組中，實(shí)驗(yàn)組里上述4個(gè)上調(diào)的miRNA表達(dá)均減少，而miRNA-181b和miRNA-489表達(dá)增加，表明熱量限制能夠逆轉(zhuǎn)衰老骨骼肌中某些特定的miRNA表達(dá)水平，并且CR飲食組較正常飲食組具有更高的肌肉量。Hu等在嚙齒類動(dòng)物的研究里也取得了可喜的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)在衰老的小鼠和大鼠里，miRNA-29呈顯著的高表達(dá)，miRNA-29通過結(jié)合P85α，IGF-1及B-myb的3′-UTR來抑制其表達(dá)；同時(shí)，上調(diào)細(xì)胞周期抑制物P53，P16及pRB的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高表達(dá)的miRNA-29使骨骼肌干細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表型，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受到抑制，進(jìn)而出現(xiàn)肌肉的萎縮[36]。此外還明確了Wnt3a能刺激miRNA-29表達(dá)上調(diào)。有趣的是，miRNA-29還同時(shí)具有促進(jìn)成肌細(xì)胞肌向分化的能力[37]，出現(xiàn)這個(gè)矛盾現(xiàn)象可能是由于增殖受限導(dǎo)致成肌前體細(xì)胞數(shù)量不足，故出現(xiàn)肌肉量減少和肌肉萎縮。

抗阻訓(xùn)練是減緩肌肉量丟失，干預(yù)肌肉減少癥進(jìn)展的重要措施，這是由于抗阻訓(xùn)練可增強(qiáng)骨骼肌蛋白質(zhì)合成有關(guān)的信號(hào)通路的表達(dá)，而IGF-1作為骨骼肌主要的調(diào)節(jié)因子，其主導(dǎo)的Akt-mTOR信號(hào)通路是骨骼肌蛋白質(zhì)合成的主要調(diào)控通路[38-39]。Zacharewicz等在人體上的研究表明，衰老的個(gè)體對(duì)一些如抗阻訓(xùn)練的合成刺激反應(yīng)性減弱，同時(shí)Akt-mTOR信號(hào)通路活性下降，蛋白質(zhì)合成代謝減弱，進(jìn)而導(dǎo)致骨骼肌萎縮[40]。在肌肉活檢組織檢測(cè)到的754個(gè)miRNA中，有9個(gè)與Akt-mTOR信號(hào)通路高度相關(guān)，5個(gè)已被證實(shí)通過結(jié)合Akt-mTOR通路上一些信號(hào)分子的3′-UTR發(fā)揮作用，其中多數(shù)屬于miRNA-99/100家族，如miR-99a-5p, miR-99b-5p和miR-100-5p等，表明這些miRNA可作為肌肉減少癥治療的潛在靶點(diǎn)。

4 展望

miRNAs作為一類重要的基因表達(dá)調(diào)控者，已被證實(shí)參與多種生理和病理過程，其作為成肌分化調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分也是在最近才逐漸得到確認(rèn)。盡管miRNAs的研究手段在不斷進(jìn)步，尤其隨著新一代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，為揭示更多miRNAs的作用機(jī)制提供重要的技術(shù)支撐，但總體研究仍處于起步階段，miRNAs在肌肉減少癥等增齡性肌肉疾病的臨床應(yīng)用價(jià)值還有待開發(fā)。相信隨著對(duì)miRNAs作用機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，定能為肌肉疾病的診斷和治療帶來新的契機(jī)。