塑化劑對慢性腎衰大鼠模型和腹膜透析患者腹膜纖維化調(diào)控因子TGF-β1/Smads表達的影響

羅來敏, 張桂玲

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治療終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)的主要手段之一，PD液的包裝材料主要是聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)。為改善PVC的性能，通常需要添加塑化劑，這類物質(zhì)不能牢固結(jié)合，進入人體內(nèi)可導(dǎo)致一系列的不良后果[1]。文獻報道，塑化劑的主要成分鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate，DEHP)能刺激人腹膜間皮細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，其機制可能是通過腹膜纖維化調(diào)控因子——轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介導(dǎo)的[2]。為進一步驗證DEHP對腹膜纖維化的影響和TGF-β1/ Smad蛋白家族(sma madrelated family,Smads)通路在其中的作用，筆者擬建立SD大鼠慢性腎衰模型，觀察塑化劑的主要成分DEHP對腎衰大鼠腹膜纖維化關(guān)鍵因子TGF-β1/Smads表達的影響，并在人體中對比2種不同包裝材料的腹透液對PD充分性、腹膜功能和腹透液中TGF-β1濃度的差別，探討塑化劑與腹膜纖維化的關(guān)系和可能機制。

1 對象與方法

1.1對象 維持性PD時間1～6月且未發(fā)生過腹膜炎的維持性腹透患者16例，隨機分為PVC組和非PVC組，其中PVC組男性5例，女性3例，年齡(48.9±14.7)歲(26～68歲)；非PVC組男性4例，女性4例，年齡(47.4±12.8)歲(27～63歲)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。患者均簽署知情同意書。

1.2材料 SD雄性大鼠30只，250～300 g[湖南長沙斯萊克景達有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0004]。PVC包裝PD液10袋(批號：G1408112，廣州百特醫(yī)療用品有限公司)；DEHP標(biāo)準(zhǔn)液(純度≥99%，上海將來實業(yè)股份有限公司)；正己烷(分析純，西隴化工股份有限公司)；紫外分光光度計(UV-3200型，上海元析儀器有限公司)；人 TGF-β1酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海酶研生物科技有限公司)；兔抗大鼠Smad3、兔抗大鼠Smad7、小鼠來源α-SMA多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(杭州賢至生物有限公司)；兔抗大鼠p-Smad2/3多克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗大鼠TGF-β1(美國Affinity Biosciences)；熒光(FITC)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、兔抗大鼠α-SMA抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天公司)；DEHP(美國Sigma公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen Life Techonology公司)；逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)試劑盒(北京全式金公司)；實時熒光定量PCR儀(7900型，美國ABI公司)。

1.3方法

1.3.1腹透液中DEHP的檢測 從10袋患者即將使用的PVC包裝PD液中各取10 mL，使用紫外分光光度計法得出吸光度，參照之前使用DEHP標(biāo)準(zhǔn)液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出DEHP的平均濃度，按體質(zhì)量進行校正后根據(jù)文獻[3]中人和動物劑量轉(zhuǎn)換方法確定大鼠腹腔注射的DEHP的量。考慮腹透患者的接觸DEHP的時間遠較大鼠模型長，干預(yù)濃度為計算出的DEHP給藥量的1，10，100倍。

1.3.2腹透液中TGF-β1含量的測定 取患者入組時和3月后留置4 h后的腹透液10 mL，按人TGF-β1酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書操作，測定腹透液中TGF-β1的含量。

1.3.3大鼠模型腹膜組織中TGF-β1/Smads表達的檢測

1.3.3.1分組 30只SD雄性大鼠建立5/6腎切除腎衰模型，建模成功后隨機分為5組，每組6只。(1)正常對照組(C組)：大鼠給予每日腹腔注射生理鹽水20 mL·kg-1·d-1；(2)模型對照組(O組)：大鼠腹腔每日注射玉米油20 mL·kg-1·d-1。(3)低濃度DEHP組(L組)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含0.5 mg/kg DEHP；(4)中濃度DEHP組(M組)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含5 mg/kg DEHP；(5)高濃度DEHP組(H組)：大鼠腹腔每日注射20 mL·kg-1·d-1玉米油含50 mg/kg DEHP。于實驗第28天處死動物取腹膜組織待檢。

1.3.3.2壁層腹膜和腎臟組織學(xué)觀察 組織常規(guī)脫水→透明→浸蠟→包埋→切片、烤片→脫蠟后，予蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，H-E)染色。觀察壁層腹膜纖維化程度及腹膜厚度，腎臟纖維化程度。

1.3.3.3臟層腹膜α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7和p-Smad2/3蛋白的表達 間接免疫熒光檢測α-SMA；Western-blot方法檢測α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7和p-Smad2/3。

1.3.3.4臟層腹膜α-SMA，TGF-β1，Smad3，Smad7 mRNA的表達 采用實時熒光定量PCR方法檢測。引物序列從GeneBank中查閱，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer Express2.0軟件設(shè)計(表1)。cDNA的合成及實時熒光定量PCR參照全式金相關(guān)試劑盒操作程序進行。Rt-qPCR反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s預(yù)變性→94 ℃ 5 s→60 ℃30 s共40個循環(huán)。最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

表1 引物序列表

Rat TGF-β1：鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β1；Rat Smad3：鼠信號傳導(dǎo)蛋白Smad3；Rat Smad7：鼠信號傳導(dǎo)蛋白Smad 7；Rat α-SMA：鼠α平滑肌肌動蛋白；Rat GAPDH：鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

1.3.4PD患者尿素清除指數(shù)(urea clearance index，KT/V)、肌酐清除率(creatinine clearance，Ccr)檢測和腹膜平衡試驗 參照文獻[4]方法，在入組前和入組3月后留取相應(yīng)的血液、尿液和腹透液標(biāo)本進行檢測計算。

2 結(jié) 果

2.1腹透液中DEHP的含量 腹透液中DEHP的平均濃度為460.4 μg/L，按患者體質(zhì)量計算平均每天接觸量為0.07 mg/kg，根據(jù)文獻[3]人和動物劑量轉(zhuǎn)換方法得出大鼠腹腔注射的濃度約為0.5 mg/kg，故確定的大鼠模型DEHP腹腔注射劑量為0.5，5，50 mg/kg(表2)。

2.2受試者KT/V,Ccr及血尿素氮/腹透液尿素氮比值[blood urea nitrogen/peritoneal dialysis fluid urea nitrogen ratio，D/P(Urea)]、腹透液中TGF-β1的含量 入組時、3月后2組患者組間和組內(nèi)KT/V，Ccr及D/P(Urea)比較，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PVC組3月后腹透液中TGF-β1濃度較入組時明顯升高(P<0.05)；3月后非PVC組腹透液中TGF-β1濃度較PVC組明顯降低(P<0.05，表3)。

表2 腹透液中DEHP的檢測結(jié)果

DEHP：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯.

2.3大鼠腎臟和腹膜形態(tài)學(xué)改變 H-E染色顯示：5/6腎臟切除大鼠腎臟病理可見腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)彌漫增生，局灶節(jié)段性中-重度加重，腎小管上皮細(xì)胞空泡及顆粒變性，多灶狀萎縮，腎間質(zhì)多灶狀淋巴、單核細(xì)胞浸潤伴纖維化明顯，小動脈管壁增厚，玻璃樣變，參考馬林林等的文獻[5]，表明造模成功。3月后，L,M,H組腹膜較C,O組腹膜增厚，間皮細(xì)胞增生明顯，間質(zhì)中纖維母細(xì)胞增生，伴炎癥細(xì)胞浸潤。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：低濃度DEHP組；D：中濃度DEHP組；E：高濃度DEHP組；F：大鼠腎臟病理. DEHP：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯.圖1 大鼠腎臟和腹膜組織病理學(xué)變化Fig 1 Pathological changes of renal and peritoneal tissue in rats

A：正常對照組；B：模型對照組；C：低濃度DEHP組；D：中濃度DEHP組；E：高濃度DEHP組. 圖中藍色表示細(xì)胞核，紅色標(biāo)記a-SMA，白色箭頭所示為a-SMA(免疫熒光 ×400). DEHP：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯.圖2 大鼠腹膜組織a-SMA的表達Fig 2 Expression of a-SMA in rat peritoneal tissue

2.4免疫熒光顯示α-SMA在大鼠臟層腹膜組織的表達 正常腹膜組織內(nèi)α-SMA表達較少，在使用含DEHP的腹透液后，α-SMA表達明顯增加，不同濃度DEHP間，α-SMA表達無差別。免疫熒光可見α-SMA主要表達于細(xì)胞質(zhì)。

表3 受試者KT/V,Ccr，D/P(Urea)及腹透液中TGF-β1的含量

PVC:聚氯乙烯；KT/V：尿素清除指數(shù)；Ccr：肌酐清除率；D/P(Urea)：血尿素氮/腹透液尿素氮比值；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1. PVC組3月后與入組時比較，★：P<0.05；非PVC組3月后與PVC組比較，◆：P<0.05.

2.5TGF-β1，Smad3，Smad7，p-Smad2/3及α-SMA在大鼠腹膜組織的表達 正常腹膜組織內(nèi)TGF-β1，Smad3，p-Smad2/3及α-SMA有微弱的基礎(chǔ)表達。使用含DEHP的透析液后，表達明顯增加(P<0.05)；不同濃度的DEHP之間比較，表達差別無統(tǒng)計學(xué)意義。L，M，H組與C，O組比較，Smad7的蛋白及mRNA的表達下調(diào)(P<0.05，圖3，4)。

3 討 論

PD設(shè)備簡單，性價比高，臨床預(yù)后不斷改善，成為許多國家和地區(qū)ESRD患者的首選[6-8]。2015年費森尤斯公司發(fā)布的醫(yī)療質(zhì)量年度報告統(tǒng)計全球的腹透患者已超過272 000人[9]。但是PD患者的生存率并不樂觀，Mujais等分析了超過40 000例美國的PD患者，發(fā)現(xiàn)4年的生存率僅為56%左右，而技術(shù)生存率更是只有47%[10]。當(dāng)前限制PD患者長期技術(shù)生存的重要原因之一是腹膜纖維化導(dǎo)致的腹膜超濾功能喪失[10]，這類患者的死亡率也明顯高于其他腹透患者[11]。腹透液的非生物相容性是主要原因[12]。包裝材料中DEHP也可能扮演著主要角色。本研究測得腹透液中DEHP的平均濃度為460.4 μg /L，與文獻報道的350～460 μg/L一致[13]，故以該DEHP的平均濃度為劑量參考對慢性腎衰大鼠模型進行干預(yù)。

TGF-β1是多種組織器官的重要促纖維化因子，主要是通過信號蛋白Smad2/3的活化發(fā)揮作用。腹膜炎大鼠模型和腹膜纖維化大鼠模型中均發(fā)現(xiàn)腹膜組織中TGF-β1/Smads表達的上調(diào)[14-17]，表明TGF-β1/Smads是腹膜纖維化的關(guān)鍵因子。本研究發(fā)現(xiàn)，DEHP組腹膜組織中TGF-β1，Smad3及p-Smad2/3在蛋白和RNA水平均較對照組上調(diào)，表明DEHP能刺激腹膜組織上調(diào)表達成纖維因子TGF-β1并激活Smads通路，而DEHP組中成纖維樣細(xì)胞表型標(biāo)志物α-SMA表達的增加進一步提示腹膜纖維化的啟動；不同DEHP濃度對TGF-β1/Smads通路的活化程度無統(tǒng)計學(xué)差別，這與Fracasso等的研究一致[13]，提示這種激活可能為非劑量依賴性或日常的接觸劑量就足以完全激活該通路。腹膜組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，DEHP組可見大鼠腹膜組織表現(xiàn)出間皮細(xì)胞異常和纖維化趨勢， DEHP引起腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)和功能的異常，激活炎癥反應(yīng)，破壞腹膜組織正常結(jié)構(gòu)，這是腹膜功能受損的表現(xiàn)[18]，說明PVC包裝腹透液中所含的DEHP可致腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，啟動纖維化改變，其機制可能是激活組織纖維化關(guān)鍵信號TGF-β1/Smad通路。

Smad7可以抑制Smad2/3的活化、Smad3/4異源復(fù)合物的形成及核轉(zhuǎn)位，阻斷TGF-β1/Smad信號通路的活化[19-21]。本研究結(jié)果提示，Smad7同其他蛋白一樣，在對照組有一定量的基礎(chǔ)表達預(yù)防腹膜組織纖維化。當(dāng)TGF-β1激活Smad2/3蛋白時，Smad7的表達未隨之上調(diào)，而是下調(diào)，表明DEHP在激活TGF-β1及Smad2/3等促纖維化因子的同時也能抑制抗纖維化因子Smad7的表達。研究表明，基因轉(zhuǎn)染Smad7上調(diào)表達后，可以明顯抑制大鼠腹膜組織局部TGF-β1/Smad的表達和信號蛋白的活化[20-23]。這些結(jié)果可能預(yù)示著TGF-β1/Smad通路中促纖維化因子和抗纖維化因子之間的比例失衡對纖維化的進展意義更大，提示將來應(yīng)用Smad7防治腹膜纖維化可能起到重大作用。

在人體研究中，2組受試者在代表PD充分性的指標(biāo)KT/V、Ccr和代表腹膜功能的D/P值上，組間比較和組內(nèi)比較均無統(tǒng)計學(xué)差別，表明使用含DEHP的PD液透析3月不會對PD的充分性和腹膜功能產(chǎn)生明顯的影響。3月后PVC組腹透液中TGF-β1明顯高于非PVC組。Narikiyo等以不同濃度的DEHP干預(yù)SD大鼠腹膜間皮細(xì)胞，24 h后分析細(xì)胞培養(yǎng)液離心后的上清液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)的活性，顯示在常規(guī)濃度下PD液中的DEHP不會對腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生急性細(xì)胞毒性作用，同時也指出DEHP對腹膜的長期影響還需要進一步的研究[24]。筆者認(rèn)為，常規(guī)濃度的DEHP可激活腹膜組織纖維化因子，啟動組織纖維化進程，但該過程是緩慢而持久的，可能需要較長時間才能引起腹膜組織在結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)有臨床意義的改變。

C組：正常對照組；O組：模型對照組；L組：低濃度DEHP組；M組：中濃度DEHP組；H組：高濃度DEHP組. DEHP：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯. 與L，H，M組比較，△：P<0.05.圖3 大鼠腹膜組織TGF-β1，Smad3,Smad7，p-Smad2/3和α-SMA蛋白相對表達量Fig 3 The relative expression of TGF-beta 1, Smad3, Smad7, p-Smad2/3 and α-SMA protein in the peritoneal tissue of rats

C組：正常對照組；O組：模型對照組；L組：低濃度DEHP組；M組：中濃度DEHP組；H組：高濃度DEHP組. DEHP：鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯. 與L,H,M組比較，△：P<0.05.圖4 各組大鼠腹膜組織TGF-β1，Smad3,Smad7和α-SMA mRNA相對表達量Fig 4 The relative expression of TGF-β1, Smad3, Smad7 and α-SMA mRNA in the peritoneal tissue of rats

受實驗室條件、經(jīng)費、時間等條件的限制，筆者未能開展非PVC包裝PD液對PD患者長期腹膜功能的影響的研究。據(jù)報道，由解放軍三零一醫(yī)院陳香美院士牽頭聯(lián)合青島華仁醫(yī)藥有限公司正在進行一項非PVC包裝PD液對長期PD患者有效性和安全性的多中心研究[25]，期待這個研究能帶來新的結(jié)論。綜上所述，PVC包裝腹透液中的塑化劑可以激活腹膜組織纖維化進程，可能是通過TGF-β1/Smad信號通路介導(dǎo)的，但要產(chǎn)生影響腹膜功能的變化可能需要較長時間，使用非PVC包裝腹透液有可能改善PD患者長期技術(shù)生存率。