白花蛇舌草對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機(jī)制

南錫浩 于峰 田河 馬瑞 張智慧 張?jiān)马?/p>

[摘要] 目的 探討分析白花蛇舌草的提取物在膀胱癌EJ細(xì)胞株增殖抑制中發(fā)揮的作用及其機(jī)制。方法 將2016年5月—2017年5月培養(yǎng)的的膀胱癌EJ細(xì)胞株按照隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組和研究組，對(duì)照組不加任何物質(zhì)，研究組的細(xì)胞株加入白花蛇舌草的提取物，利用MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖抑制作用，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膀胱癌EJ細(xì)胞株的端粒酶含量，觀察對(duì)比兩組細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制率以及端粒酶的含量。 結(jié)果 研究組的EJ細(xì)胞株加入白花蛇舌草提取物12、24、48、72 h的生長(zhǎng)抑制率分別為（7.38±0.49）、（11.94±0.78）、（18.46±0.24）、（28.76±0.57），均明顯高于對(duì)照組的（5.14±0.38）、（7.96±0.98）、（12.64±0.37）、（15.79±0.76）（P<0.05）；而研究組細(xì)胞株12、24、48、72 h的端粒酶含量分別為（33.13±1.84）、（25.46±2.79）、（15.34±2.13）、（9.54±1.79），均明顯低于對(duì)照組的（37.16±2.31）、（31.91±2.78）、（18.49±1.4）、（12.48±2.07）（P<0.05）。結(jié)論 白花蛇舌草中的提取物應(yīng)用于膀胱癌EJ細(xì)胞中能夠有效抑制細(xì)胞的增殖作用，作用機(jī)制與端粒酶的含量有關(guān)，是一種抗腫瘤的新型藥物，在臨床上值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用，有巨大的參考價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 白花蛇舌草；膀胱癌EJ細(xì)胞株；抑制增殖；端粒酶

[中圖分類號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）01（a）-0001-03

Inhibitory Effect of Hedyotis Diffusa on Proliferation of Bladder Cancer Cell Line EJ and Its Mechanism

NAN Xi-hao1， YU Feng1， TIAN He1， MA Rui1， ZHANG Zhi-hui1， ZHANG Yue-shun2

1.Department of Urology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China； 2.Department of Anesthesiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and mechanism of extract of Hedyotis diffusa in inhibiting the proliferation of bladder cancer EJ cell line. Methods The bladder cancer EJ cell lines cultured from May 2016 to May 2017 in experimental operation were divided into control group and study group according to random number method， control group without any material， the team of cell lines to join the spreading hedyotis herb extract， determination of cell proliferation inhibition by the MTT method， and by using flow cytometry instrument to detect the contents of bladder cancer EJ cell lines of telomerase， observation compared two groups of cell lines growth inhibition rate and the content of telomerase. Results The growth inhibition rate of EJ cell line added to the extract of Hedyotis diffusa were （7.38±0.49），（11.94±0.78）， （18.46±0.24） and （28.76±0.57） at 12， 24， 48 and 72 h， respectively， which were significantly higher than that of the control group （5.14±0.38）， （7.96±0.98）， （12.64±0.37）， （15.79±0.76） （P<0.05）， while the telomerase contents in the study group at 12， 24， 48 and 72 h were （33.13±1.84） （25.46±2.79）and （15.34±2.13），（9.54±1.79）were significantly lower than the control group （37.16±2.31）， （31.91±2.78）， （18.49±1.49）， （12.48±2.07） （P<0.05）. Conclusion Of spreading hedyotis herb extract used in bladder cancer EJ cells can effectively inhibits the proliferation of cells， the mechanism of action is associated with the levels of telomerase， is a new type of antitumor drug， worthy of further popularization and application in clinic， has great reference value.

[Key words] Hedyotis diffusa； Bladder cancer EJ cell line； Inhibition of proliferation； Telomerase

膀胱癌通常是發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，也是泌尿系統(tǒng)中最為高發(fā)多見(jiàn)的疾病，膀胱癌在任何年齡都有發(fā)病的可能，發(fā)病率近年來(lái)隨著年齡的增長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)，而且男性膀胱癌發(fā)病率大約為女性的3～4倍，膀胱癌患者的臨床表現(xiàn)是無(wú)痛性、肉眼可見(jiàn)、間歇性血尿，出現(xiàn)排尿困難，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。膀胱癌屬于移行細(xì)胞癌，手術(shù)后患者會(huì)在很短時(shí)間內(nèi)再次復(fù)發(fā)，并且有病情加重的危險(xiǎn)，該疾病應(yīng)用手術(shù)治療不能獲得滿意的療效，所以一般會(huì)采用化療輔助治療膀胱癌，常用化療藥物為絲裂霉素、吡柔比星、卡介苗等，但是化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的過(guò)程中也會(huì)殺傷正常細(xì)胞，給患者帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。白花蛇舌草藥味偏苦、淡，性寒，有著清熱解毒、利尿除濕、消痛散結(jié)的良好功效，善于治療各種炎癥?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，白花蛇舌草提取物通過(guò)激活T細(xì)胞，釋放大量的干擾素，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，除此之外，白花蛇舌草提取物還能夠增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，能夠促使機(jī)體增強(qiáng)防御功能。該研究選取2016年5月—2017年5月培養(yǎng)的的膀胱癌EJ細(xì)胞株，旨在探討分析白花蛇舌草提取物在膀胱癌EJ細(xì)胞株增殖抑制中發(fā)揮的作用及其機(jī)制，從而為膀胱癌的治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞來(lái)源為人膀胱癌EJ細(xì)胞株、從中藥房購(gòu)買白花蛇舌草，將藥草浸泡后煮沸一段時(shí)間，過(guò)濾后將提取液濃縮后配比加入乙酸乙酯和乙醇，來(lái)回抽濾后獲得純度較高的提取物，然后放入冰箱待用[2]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2恒溫電熱培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、流式細(xì)胞儀、倒置顯微鏡、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、微孔濾器、低溫冰箱、振蕩器。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、單克隆抗體等。

1.1.4 利用隨機(jī)數(shù)字法 將膀胱癌EJ細(xì)胞株分為對(duì)照組和研究組，在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行同步培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)的環(huán)境完全相同[3]。該實(shí)驗(yàn)符合細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的規(guī)定，兩組細(xì)胞株的一般資料對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 先培養(yǎng)對(duì)照組和研究組的細(xì)胞株，膀胱癌EJ細(xì)胞株是單層細(xì)胞，并且貼壁生長(zhǎng)，將細(xì)胞株在含有胎牛血清、鏈霉素、青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將培養(yǎng)瓶放入CO2恒溫電熱培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組細(xì)胞株中不需要加入任何物質(zhì)，只需每日更換培養(yǎng)液，隔一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，而研究組的細(xì)胞株接種培養(yǎng)到一定階段時(shí)，加入白花蛇舌草提取物，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[4]。

1.2.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 用MTT法測(cè)定白花蛇舌草提取物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，首先取指數(shù)生長(zhǎng)期EJ細(xì)胞株用胰酶消化后接種于96孔細(xì)胞板上，在CO？恒溫電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液后加入胎牛血清培養(yǎng)，一段時(shí)間后每孔加入MTT25 μL，繼續(xù)孵育4 h，再將上清液棄去，每孔再加入100 μL二甲基甲砜，利用振蕩儀使結(jié)晶物溶解充分，最后用聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)出兩組細(xì)胞的吸光度A值[5]。細(xì)胞抑制率=（1-研究組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.2.3 定量檢測(cè)兩組細(xì)胞株的端粒酶含量 將對(duì)照組和研究組的膀胱癌EJ細(xì)胞株中加入單克隆抗體，并在CO？恒溫電熱培養(yǎng)箱中孵育30 min，去上清后，放入冰箱中保存24 h后，利用儀器檢測(cè)端粒酶的含量[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

計(jì)算兩組膀胱癌EJ細(xì)胞株的細(xì)胞抑制生長(zhǎng)率，細(xì)胞抑制率由MTT法檢測(cè)出的細(xì)胞吸光度代入公式得出。此外用流式細(xì)胞儀測(cè)出兩組膀胱癌EJ細(xì)胞株的端粒酶含量，比較分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

研究組細(xì)胞株的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1。

研究組細(xì)胞株的端粒酶含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

膀胱癌屬于移行細(xì)胞癌，是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)高發(fā)的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，且男性發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性，臨床上對(duì)于膀胱癌的治療方式仍以手術(shù)、化療為主，化療的常用藥物為絲裂霉素、阿霉素、干擾素、吡柔比星、卡介苗等，但是這些治療手段僅能暫時(shí)延長(zhǎng)患者的壽命，一段時(shí)間后仍會(huì)復(fù)發(fā)而且有加重病情的危險(xiǎn)，這些抗癌藥物都是通過(guò)一級(jí)動(dòng)力學(xué)原理來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞，阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治愈疾病的目的[7]。但是腫瘤細(xì)胞的繁殖率相當(dāng)高，殘存的細(xì)胞成為誘發(fā)癌癥復(fù)發(fā)的主要原因，所以說(shuō)尋找具有高誘發(fā)癌細(xì)胞凋亡，遏制細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的高效抗腫瘤藥物在臨床治療中有著重要的意義，能夠有效預(yù)防疾病的發(fā)展。

白花蛇舌草中藥味偏苦，偏淡，屬于性寒植物，具有清熱解毒、利尿除濕的功效，常用于治療各種炎癥[8-9]。該研究將白花蛇舌草提取物加入研究組，對(duì)照組不加任何物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及端粒酶含量的測(cè)定，觀察兩組細(xì)胞株對(duì)于膀胱癌腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其作用機(jī)制， 數(shù)據(jù)顯示72 h后研究組的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（28.76±0.57），顯著高于對(duì)照組的抑制率（15.79±0.76）（P<0.05）；72 h后研究組的端粒酶含量為（9.54±1.79），顯著低于對(duì)照組的（12.48±2.07）（P<0.05）。中國(guó)老年學(xué)雜志發(fā)表的《白花蛇舌草對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機(jī)制》中也做過(guò)類似的實(shí)驗(yàn)，選擇不同濃度的白花蛇舌草提取物分不同的時(shí)間段作用于膀胱癌EJ細(xì)胞株，72 h后1.5 μg/L的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到峰值（53.24±4.03），流式細(xì)胞儀檢測(cè)加藥后對(duì)照組端粒酶含量為（42.465±3.987），實(shí)驗(yàn)組0.5、1、1.2、1.5 μg/L組端粒酶含量分別為（33.580±1.842）、（25.710±3.222）、（15.334±2.555）、（9.118±1.874）。與該實(shí)驗(yàn)不同的是沒(méi)有分對(duì)照組和研究組，只選取不同濃度的白花蛇舌草提取物進(jìn)行研究對(duì)比，但是都說(shuō)明了隨著時(shí)間的推移以及濃度的增加，白花蛇舌草在腫瘤細(xì)胞增殖抑制中發(fā)揮的作用越來(lái)越強(qiáng)，端粒酶的含量也在顯著下降。

研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草提取物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的作用機(jī)制是通過(guò)減少端粒酶含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的，端粒是由真核細(xì)胞染色體內(nèi)一段重復(fù)串聯(lián)的DNA序列和相應(yīng)的蛋白質(zhì)組成的，在細(xì)胞分裂增殖時(shí)，端粒的末端會(huì)逐漸縮短，它的功能是維持染色體的恒定，隨著細(xì)胞的復(fù)制，端?？s短到一定程度時(shí)無(wú)法行使它的功能，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞停止增值死亡[10]。而端粒酶是一種核糖蛋白酶，補(bǔ)充作用于逐漸縮短的染色體末端，所以說(shuō)腫瘤的惡化程度越高，端粒酶活性越高，含量越多。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)用流式細(xì)胞儀測(cè)定兩組細(xì)胞株的端粒酶含量，可以分析得到白花蛇舌草提取物抗腫瘤、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的作用。

綜上所述，通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)MTT法以及流式細(xì)胞儀的測(cè)定，充分證明白花蛇舌草提取物對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、減少端粒酶數(shù)量、降低端粒酶活性都發(fā)揮著重要的作用，為臨床上治療膀胱癌提供了參考，臨床上應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

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（收稿日期：2017-10-08）