端粒酶活性與白內(nèi)障

王杰 康剛勁

端粒和端粒酶是聯(lián)結(jié)著增殖與衰老的一條紐帶。端粒被稱為細(xì)胞有絲分裂的“生命時鐘”，端粒酶的激活與抑制決定著端粒的長度并最終影響細(xì)胞的存亡。近年來，大量研究證明，人晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LECs)中存在端粒酶活性，其活性改變與白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，通過影響端粒酶活性對白內(nèi)障進行靶向治療有可能成為白內(nèi)障防治的新手段。

1 端粒、端粒酶、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

1.1 端粒 端粒是真核細(xì)胞染色體3’末端的非編碼DNA序列，它是一種能穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和功能的特殊成分，在染色體的復(fù)制、保護染色體不被核酸降解、防止染色體相互融合和控制細(xì)胞生長壽命等方面起重要作用。

1.2 端粒酶 端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，以自身RNA為模板，不斷合成新的端粒DNA序列，添加到端粒末端，彌補其在復(fù)制中的丟失，解決末端復(fù)制問題，維持端粒長度的穩(wěn)定，賦予細(xì)胞無限增殖能力。端粒酶對調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、增殖、轉(zhuǎn)化及腫瘤形成具有重要作用。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，其在很多細(xì)胞內(nèi)通路中的作用超過了在端粒長度的維持和復(fù)制性衰老方面的作用，這些作用包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中細(xì)胞凋亡、基因表達和DNA損傷應(yīng)答等［1］。大量研究表明，除眼部腫瘤外，其他眼部增生組織及生長活躍組織亦表達端粒酶活性。LECs與皮膚基底細(xì)胞來源于同一胚層，具有相似的性質(zhì)，一生中處于不斷增殖狀態(tài)以形成晶狀體纖維細(xì)胞，提示LECs可能具有干細(xì)胞特性，其表達端粒酶活性與理論相符合。20世紀(jì)末，Colitz等［2］應(yīng)用端粒重復(fù)片段擴增-酶聯(lián)免疫技術(shù)(telomeric repeat amplification-ELISA，TRAP-ELISA)首次對LECs進行了端粒酶的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)犬LECs中有端粒酶活性的表達，認(rèn)為端粒酶活性的失調(diào)與白內(nèi)障的形成密切相關(guān)。

1.3 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 端粒酶由3個亞單位構(gòu)成—端粒酶RNA成分(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶蛋白1(human telomerase protein1，hTP1)和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)，分別被稱為模板、調(diào)節(jié)亞基、催化亞基。其中hTERT具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，在大多數(shù)端粒酶陽性的腫瘤和永生化細(xì)胞系中hTERT的表達與端粒酶活性呈正相關(guān)。hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)節(jié)端粒酶活性的重要限速步驟。在體外，僅有hTR與hTERT兩種成分就能表達出完整端粒酶活性。

2 端粒酶活性與白內(nèi)障的關(guān)系

白內(nèi)障病因復(fù)雜多樣，以往研究多集中在離子失衡、晶狀體蛋白改變、氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)等方面，近年來在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中觀察到端粒酶活性的改變成為又一熱點。該領(lǐng)域存在著兩大相互矛盾的觀點，部分研究者認(rèn)為白內(nèi)障LECs中端粒酶活性高于透明晶狀體，另有部分研究者的研究結(jié)果卻表明年齡相關(guān)性白內(nèi)障組LECs中端粒酶活性低于正常組。說明端粒酶在白內(nèi)障形成過程中的作用機制可能不止一種。目前學(xué)者們爭論的焦點在于:白內(nèi)障LECs中端粒酶活性的改變與細(xì)胞DNA損傷、增殖的關(guān)系，即這種活性的改變是引起白內(nèi)障的原因還是白內(nèi)障的繼發(fā)改變呢?

2.1 端粒酶活性的增加作為白內(nèi)障形成的繼發(fā)改變 Colitz等［2］發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障組LECs中端粒酶活性及端粒長度明顯高于透明晶狀體組，且端粒酶活性的表達水平與動物的年齡呈正相關(guān)。支持這一論點的學(xué)說為:端粒酶的抗凋亡和促修復(fù)機制。

大量研究表明，除了維持端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性這一主要作用外，端粒酶還能抑制細(xì)胞凋亡［3］。2000年，Xiang等［4］將 hTERT 導(dǎo)入兔 LECs中，hTERT與兔端粒酶模板結(jié)合下調(diào)p53、Caspase-3水平，上調(diào)bcl-2水平，抑制細(xì)胞凋亡。Lu等［5］使用端粒酶反義寡核苷酸和聚合酶作為特異性抑制劑轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞沉默端粒酶靶基因的表達，結(jié)果表明:端粒酶活性受到抑制，且A549細(xì)胞的凋亡率明顯上升。Korkmaz等［6］發(fā)現(xiàn)十水硼酸鈉(disodium pentaborate decahydrate，DPD)通過降低hTERT活性從而誘導(dǎo)人前列腺癌DU145細(xì)胞的凋亡。端粒酶活性干預(yù)凋亡過程，凋亡途徑參與端粒酶活性調(diào)節(jié)。白內(nèi)障的形成即LECs的衰老和凋亡的過程，隨著年齡的增長，體內(nèi)微環(huán)境的改變以及紫外線等電離輻射對LECs損傷的不斷積累不可避免地導(dǎo)致LECs發(fā)生衰老和凋亡，LECs的衰老和凋亡均不利于晶狀體維持其正常的生理功能及透明度，最終形成白內(nèi)障。在終生具有有絲分裂能力、分裂增殖旺盛的赤道部和旁中央部LECs中可明顯檢測出端粒酶活性，隨著動物年齡的增加端粒酶活性的表達水平上升，表明端粒酶起著對抗LECs的衰老和凋亡的作用。隨著白內(nèi)障的繼續(xù)進展，端粒酶活性的增加也不足以抵抗端?？s短時，LECs就會退出細(xì)胞循環(huán)而進入程序性死亡。

端粒酶在LECs中存在促修復(fù)機制。終生具有有絲分裂的旁中央部、赤道部以及靜止的中央?yún)^(qū)LECs中檢測到相同水平的端粒酶活性。Sorte等［7］認(rèn)為，這是由于中央?yún)^(qū)透明晶狀體無虹膜屏蔽，終生都在不斷接受以紫外線為主要形式的電離輻射，誘發(fā)DNA斷裂，染色體損傷，端?？s短。年齡相關(guān)性白內(nèi)障LECs中存在著DNA氧化損傷。綜上，端粒酶活性的表達是對紫外線或氧化應(yīng)激所致?lián)p傷直接或間接的結(jié)果。在觀察紫外線誘導(dǎo)的人LECs DNA損傷修復(fù)過程中端粒酶活性和氧化損傷蛋白的變化時發(fā)現(xiàn)紫外線誘導(dǎo)的人LECs DNA損傷修復(fù)過程中端粒酶活性上調(diào)，其中TERT和hTR水平在紫外線照射的最初24 h升高最為明顯［8］。端粒長度的維持與DNA損傷修復(fù)機制之間存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系，早在2006年，Slijepcevic［9］便提出端粒長度維持與DNA損傷修復(fù)的“一體化”模式。Babizhayev等［10］研究表明，端粒在人類LECs形成白內(nèi)障過程中的縮短速率受到DNA氧化損傷的調(diào)控，并且會根據(jù)其抗氧化能力的不同而有差異。

LECs中端粒酶的抗凋亡和促修復(fù)機制存在很多交叉點，但殊途同歸，二者最終通過延緩細(xì)胞衰老與凋亡、修復(fù)相關(guān)損傷在維持LECs的透明性和防治白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展中具有不可替代的作用。

2.2 端粒酶活性的改變作為始動因素導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生 也有實驗不支持上述結(jié)論，這些實驗結(jié)果證實端粒酶活性的下降作為始動因素導(dǎo)致了年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。徐國光等［11］探討年齡相關(guān)性白內(nèi)障及正常LECs中端粒酶活性的表達時發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)性白內(nèi)障組LECs中端粒酶活性明顯低于正常組。LECs在體外培養(yǎng)、傳代過程中脫離體內(nèi)微環(huán)境，失去了“干細(xì)胞”特性，向終末表型分化(由上皮型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細(xì)胞)，端粒酶活性逐漸喪失，衰老細(xì)胞增多，最終發(fā)生白內(nèi)障。Min等［12］在后續(xù)研究中采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶缺口標(biāo)記原位細(xì)胞檢測法以及TRAP-ELISA法檢測三個不同年齡組白內(nèi)障患者LECs的凋亡和端粒酶活性。結(jié)果表明隨著年齡的增長白內(nèi)障LECs端粒酶活性逐漸降低，凋亡逐漸增強。從而得出白內(nèi)障的一個重要發(fā)病機制:端粒酶活性的降低促進了LECs的凋亡。

Lü等［13］探討端粒酶活性在兔后囊膜混濁(posterial capsular opacity，PCO)LECs中的表達時得出結(jié)論:白內(nèi)障術(shù)后發(fā)生的PCO，是由于赤道部LECs中端粒酶活性的增加作為始動因素使此處的LECs不斷增殖并移行至后囊膜分化為成纖維細(xì)胞所致。因此，抑制LECs增殖是預(yù)防PCO發(fā)生的關(guān)鍵。正常后囊膜無LECs，故不應(yīng)存在端粒酶活性，然而該實驗證實該處與赤道部LECs中均存在端粒酶活性，雖然該處活性低于赤道部。說明通過抑制端粒酶活性不僅可作用于PCO的LECs，更重要的是對其“起源細(xì)胞”即赤道部LECs也有作用。這為抑制白內(nèi)障術(shù)后LECs的增殖提供理論和實踐依據(jù)。

3 端粒酶活性的調(diào)節(jié)與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展

3.1 端粒酶活性的誘導(dǎo) 各種慢性氧化作用可損傷LECs的端粒結(jié)構(gòu)，加劇端粒的縮短，設(shè)法通過上調(diào)端粒酶的活性而維持端粒的正常長度則可以防止LECs的凋亡。因TERT聯(lián)合TR時有促進細(xì)胞增殖的作用，TERT單獨存在時則發(fā)揮抗凋亡與促修復(fù)的作用以保護LECs免遭諸如紫外線輻射等導(dǎo)致的急慢性氧化損傷，通過基因手段僅轉(zhuǎn)染TERT基因誘導(dǎo)端粒酶活性后不會同時加劇LECs的增殖而加重白內(nèi)障。轉(zhuǎn)染hTERT基因可改變核基質(zhì)與端粒的結(jié)合，下調(diào)細(xì)胞衰老相關(guān)基因的表達，上調(diào)DNA修復(fù)相關(guān)基因活性，增加端粒的穩(wěn)定性，降低染色體自發(fā)損傷，使細(xì)胞保持表型的年輕狀態(tài)。hTERT在端粒延長過程中起著不可替代的作用，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)改變端粒酶尤其是hTERT的基因表達水平，將成為白內(nèi)障基因治療的一個新突破口。1998年，Bodnar等［14］首先將外源性 hTERT 導(dǎo)入原本無端粒酶活性的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，其端粒酶轉(zhuǎn)為陽性，端粒保持穩(wěn)定，細(xì)胞壽命延長。2005年，研究者們發(fā)現(xiàn)將hTERT基因?qū)肱ECs抑制該細(xì)胞的分化［15］，LECs進入細(xì)胞凋亡歸因于端粒的縮短以及分化標(biāo)記物-β晶體蛋白的積累。hTERT通過合成新的端粒防止細(xì)胞凋亡，同時調(diào)控蛋白激酶C、蛋白激酶A的表達，最終抑制MEK/ERK信號通路，從而抑制β晶體蛋白的分化。因轉(zhuǎn)染hTERT基因所誘導(dǎo)的端粒酶活性在LECs中起保護作用而非促增殖作用［16］。所以通過轉(zhuǎn)染hTERT的基因手段誘導(dǎo)端粒酶活性的方法消除了端粒酶促細(xì)胞增殖的作用，很大程度上減少全身性誘導(dǎo)端粒酶活性誘發(fā)其他端粒酶敏感組織發(fā)生惡性腫瘤的副作用。

hTERT基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，激活因子包括c-Myc癌基因、squmosa啟動子結(jié)合樣蛋白(squmosa promoter binding protein like，SPl)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor，NF-κB)、上游刺激因子(upstream stimulating factor，USF)、病毒基因如人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、細(xì)胞核因子 (nuclear factor，NFAT)等［17］。這些轉(zhuǎn)錄激活因子作為重要的端粒酶激活劑，可顯著上調(diào)hTERT啟動子的表達，并且與其劑量呈正相關(guān)。

3.2 端粒酶活性的抑制 PCO是白內(nèi)障術(shù)后最常見的影響視力的并發(fā)癥［18］。PCO的LECs中存在著端粒酶活性。端粒酶在PCO中扮演著促進細(xì)胞增殖的作用，抑制端粒酶活性在防治PCO中的應(yīng)用價值顯得尤為重要。近年來，以端粒酶為靶點的抑制劑廣被報道［19］，例如:目前正處于三期臨床試驗的寡核苷酸類端粒酶抑制劑GRN163L［20］等，該類藥物主要是利用反義技術(shù)對hTR進行抑制，GRN163及其類似物GRN163L是一個極其成功的寡核苷酸類模版抑制劑，其最獨特的作用在于對干細(xì)胞的抑制作用明顯。其他類型的端粒酶抑制劑如核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 ddG、AZT等，非核苷類小分子抑制劑MKT077、BIBR1532 等，G-四聯(lián)體穩(wěn)定劑 SOT-095等。2012年，Lu等［21］在探討 RNA 干擾(RNA interference，RNAi)抑制hTERT對LECs增殖的影響時得出結(jié)論:較長時間RNAi hTERT能有效抑制LECs增殖。轉(zhuǎn)錄抑制因子在基因水平上對端粒酶活性進行負(fù)向調(diào)控，包括p53、腫瘤基因(wilms tumor1，WTl)、Madl轉(zhuǎn)錄因子和巨噬細(xì)胞活化因子-2(macrophage activating fsctors，MAF-2)等［22］。抑癌基因 p53 對hTERT基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用表現(xiàn)在:一方面通過抑制Sp1結(jié)合到其啟動子上而間接實現(xiàn)。另一方面，在DNA損傷的同時，活化的p53誘導(dǎo)生長因子的表達從而激活RAS/RAF/MEK/ERK信號通路。

3.3 端粒酶活性的其他調(diào)節(jié)方式 人類透明晶狀體中含有大量的L-肌肽，成熟白內(nèi)障晶狀體中卻明顯耗 盡。 研 究 表 明［23-25］，N-乙 酰 肌 肽 (N-acetyl carnosine，NAC)滴眼液所釋放的肌肽在生理濃度便可顯著降低在缺乏有效抗氧化保護的LECs中由氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的端?？s短率。在NAC滴眼液治療的老年性白內(nèi)障患者中其視力與光敏感度相比對照組表現(xiàn)出顯著改善。局部使用NAC與羧甲基纖維素混合的眼液可以使肌肽緩慢地釋放入房水和晶狀體中，通過減少氧化應(yīng)激損傷而減少LECs中的端粒縮短，從而防止LECs的凋亡。NAC抑制LECs凋亡可作為年齡相關(guān)性白內(nèi)障以及PCO的一種基本預(yù)防保健措施。

LECs進入G1/S期后端粒酶活性逐漸增高，于S期達最高，進入G2/M期后細(xì)胞幾乎喪失端粒酶活性。雌激素使細(xì)胞周期發(fā)生改變，使更多的細(xì)胞進入S期從而提高端粒酶活性［24］。另有研究［25］發(fā)現(xiàn)在白內(nèi)障 LECs中，雌激素受體(estrogen receptor，ERα)與TERT之間存在相互作用，但在正常LECs中ERα和TERT之間卻不存在這種相互作用。白內(nèi)障LECs中ERα蛋白及端粒酶mRNA的表達較正常LECs增加，ERα通過某種機制可以增加 LECs中TERT的表達。

4 小結(jié)

端粒酶活性與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，以端粒酶為靶點可能成為白內(nèi)障治療的一個新方向。目前該領(lǐng)域研究尚存在以下問題:(1)對端粒酶活性與白內(nèi)障的研究主要集中在年齡相關(guān)性白內(nèi)障與PCO，而在其他類型白內(nèi)障研究中尚未展開。(2)LECs中端粒酶活性的變化調(diào)節(jié)可能存在不同的、復(fù)雜的調(diào)控機制。由此預(yù)測，對不同類型白內(nèi)障以及同種類型不同LECs發(fā)育時期端粒酶活性及作用變化規(guī)律的深入探索，在LECs發(fā)生、發(fā)育的不用時期采用誘導(dǎo)或抑制端粒酶活性等干預(yù)措施，可能會成為白內(nèi)障治療的新靶點。

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