香樟不同樹齡和組織的端粒酶活性測定

劉立盤 鐘永達(dá) 楊愛紅 周 華 陳彩慧 胡 萍 余發(fā)新

（江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西省觀賞植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330096）

端粒位于真核細(xì)胞線性染色體末端，由DNA重復(fù)序列與蛋白質(zhì)組成的特異復(fù)合體結(jié)構(gòu)[1]。幾乎所有高等植物的端粒都是由七核苷酸擬南芥端粒重復(fù)序列（TTTAGGG）n組成[2]。樟屬牛樟（Cinnamomum kanehirae）基因組測序在染色體末端存在大量的“TTTAGGG”七聚體序列，拷貝數(shù)范圍在320～2 547之間[3]。

端粒酶是能夠延長端粒序列的一種特殊的反轉(zhuǎn)錄酶，其功能是以自身的RNA亞基作為模板，在染色體的末端添加端粒保守重復(fù)序列，維持染色體的穩(wěn)定性[4]。端粒酶是一種位于線性染色體3"末端的核糖核蛋白（RNP），由端粒酶RNA（TER）和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）2個(gè)核心亞基組成[5]。TER是由1個(gè)單一的長鏈非編碼RNA序列組成，TERT亞基包含N-末端域（TEN）、TR結(jié)合域（TRBD）、中心逆轉(zhuǎn)錄酶域（RT）和C-末端延長域（CTE）保守結(jié)構(gòu)[6]。端粒酶在各個(gè)亞單位的協(xié)作下補(bǔ)償端粒在染色體復(fù)制過程中所產(chǎn)生的持續(xù)性丟失序列，調(diào)控端粒的延長和縮短[7]。

在木本植物中，衰老是受多因素調(diào)控的生理生化動態(tài)變化的過程，樹齡是機(jī)體衰老的直接反映，端粒酶活性與植物樹齡的研究近年來有不少報(bào)道。銀杏（Ginkgo biloba）葉片端粒酶活性隨樹齡的增加呈下降的趨勢[8-9]，但狐尾松（Pinus longaeva）根系端粒酶活性隨著樹齡的增加而升高[10]。說明端粒酶活性與樹齡存在直接或者間接的關(guān)系，在調(diào)節(jié)樹種壽命方面起著至關(guān)重要的作用。

植物不同組織的分化能力不一致導(dǎo)致端粒酶活性存在差異。銀杏胚性愈傷組織、小孢子和葉片的端粒酶活性存在差異，其中胚性愈傷組織的端粒酶活性最高[9]；擬南芥（Arabidopsis thaliana）和女婁菜（Melandrium album）萌發(fā)的幼苗和根尖的端粒酶活性最高，休眠的種子中沒有活性[11]；大麥（Hordeum vulgare）的胚、花藥和心皮組織端粒酶活性較高，在胚胎發(fā)育過程中活性逐漸降低[12-13]；另外在大豆（Glycine max）根尖、菜花（Brassica oleracea）分生組織和胡蘿卜（Daucus carota）懸浮培養(yǎng)組織中端粒酶活性較高[14]。說明端粒酶活性與細(xì)胞和組織的分化能力有重要的關(guān)系。

多年生木本植物在生長過程中，不同組織部位的發(fā)育時(shí)間不一致，導(dǎo)致其生理年齡存在差異。葉片的生理年齡表征了植物生長的不同生理階段，反映了植物組織的生長和分化能力[15]。油松（Pinus tabulaeformis）和銀杏不同葉位的葉片端粒酶活性與葉位高度呈正相關(guān)關(guān)系，隨著葉片高度的增加端粒酶活性升高[8]。油松新葉的端粒長度短于老葉，但端粒酶活性高于老葉[16]；另外還發(fā)現(xiàn)銀杏[9]、油松[16]及青梣（Fraxinus pennsylvanicavar.subintegerrima）和 旱 柳（Salix matsudana）[17]樹種在全年發(fā)育周期中端粒酶活性具有季節(jié)性變化，與月平均溫度呈現(xiàn)正或負(fù)相關(guān)性關(guān)系。因此端粒酶活性在不同樹種、不同生長階段和不同生理階段均存在差異性。

本研究以7株不同樹齡香樟（Cinnamomum camphora）為材料，測定不同樹齡葉片、不同葉位高度葉片、新葉和老葉、以及8個(gè)不同組織的端粒酶活性，研究端粒酶活性與樹齡、葉片生理年齡的相關(guān)性，以及香樟不同組織的端粒酶活性的差異，為香樟的端粒酶分子機(jī)理研究及古香樟種質(zhì)資源的保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從江西省樂安縣“中國第一古樟林”古樟群落、安?？h古樟群落和南昌黃馬基地，根據(jù)古樹樹齡標(biāo)識采集7個(gè)年齡段（5，100，210，460，700，900和1 200年）的香樟葉片（表1）。取樣的方法：新葉和老葉取樹干基部一級分支的小于1 a的當(dāng)年生和大于1 a的往年生葉片，不同葉位高度的葉片取每棵樹莖基部、莖1/3高度、莖2/3高度、莖頂端4個(gè)枝條頂梢葉片，不同組織取種皮、莖干樹皮、枝條樹皮、老葉、嫩葉、葉芽、花芽和花測定端粒酶活性，每個(gè)組織和部位取樣3次作為生物學(xué)重復(fù)。

1.2 端粒酶蛋白的提取

對香樟葉片和不同組織提取端粒酶蛋白，端粒酶蛋白提取使用CHAPS裂解液：50 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）、20.0 mmol/L EGTA、0.5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）CHAPS、10%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）甘油、5.0 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L 苯 甲 脒、0.1 mmol/L PMSF、2.0 mmol/L 亞精胺、5.0 mmol/L DTT、1.5%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）PVP。

參照Kim等[18]和王瑾瑜等[19]提出的方法，稱取約100 mg香樟組織和葉片，液氮研磨置于預(yù)冷的CHAPS裂解液700 μL（5 μL DTT和10 μL PMSF），充分混勻后，冰浴裂解30 min。取上清液置于新的離心管，加入PEG8000使其終濃度為10%，冰浴懸浮放置30 min，其間不斷上下顛倒混勻。在4 ℃ 下16 000 g離心10 min，沉淀重置于CHAPS裂解液175 μL，充分混勻后，冰浴懸浮放置30 min。在4 ℃下16 000 r/min離心5 min，迅速取出上清，分裝后于-80 ℃保存。

1.3 端粒酶擴(kuò)增引物的篩選

根據(jù)木本等植物端粒酶活性測定不同引物的篩選研究[14,19]，本研究選擇6條先導(dǎo)引物（GG，GGG，TS21，PBR，47F和TS18）和1條反向引物RP對香樟葉片的端粒酶蛋白進(jìn)行PCR擴(kuò)展，篩選擴(kuò)展條帶最清晰的為最佳引物（表2）。

表 2 端粒酶活性PCR擴(kuò)增引物Table 2 PCR amplification primer of telomerase activity

1.4 香樟端粒酶活性的測定

對不同樹齡的香樟葉片，不同葉位高度和生理年齡的葉片，及不同組織按照TRAP方法，使用篩選的最佳引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測定端粒酶活性。

PCR反 應(yīng) 體 系 為50 μL：10×TRAP buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 1 μL，先導(dǎo)引物1 μL，反向引物RP 1 μL，Taq酶1 μL，端粒酶提取液2 μL，DEPC H2O 39 μL。

PCR擴(kuò) 增 程 序：PCR儀 延 伸30 ℃ 30 min；預(yù)變性95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠中加入1×SYBR Green I（Solarbio）染色液，然后置于Gel Doc XR凝膠成像儀下觀察拍照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Quantity one軟件對凝膠圖片進(jìn)行半定量分析，使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對數(shù)據(jù)結(jié)果采用IBM SPSS 19軟件進(jìn)行單因素方差分析，以LSD法評價(jià)顯著性。根據(jù)得到的端粒酶活性值，用GraphPad Prism 5繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟葉片端粒酶活性測定引物篩選

端粒酶測定引物篩選結(jié)果顯示引物：TS21和RP擴(kuò)展凝膠圖能看到明顯的6 bp遞增的條帶，其他引物凝膠圖6 bp條帶比較模糊，及檢測不到6 bp的擴(kuò)展條帶。端粒酶提取液作為陰性對照，陰性對照只有1條內(nèi)參條帶（圖1）。

圖 1 不同先導(dǎo)引物在香樟葉片端粒酶活性的PCR擴(kuò)增效果Fig. 1 PCR amplification effects on leaf telomerase activity of different forward primers in C. camphora

2.2 不同樹齡香樟葉片端粒酶檢測

為了研究不同樹齡香樟與端粒酶活性的關(guān)系，選取不同樹齡香樟莖基部相同葉位高度的葉片，對其進(jìn)行端粒酶電泳及活性測定，從圖2可以看出，樹齡5年的端粒酶活性為1.70，樹齡1 200 a的端粒酶活性為0.80?？梢钥闯龆肆Ｃ富钚噪S著香 樟 樹 齡（5，100，210，460，700，900 a和1 200 a）的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，說明在香樟5～1 200 a，端粒酶活性與樹齡存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖 2 不同樹齡香樟葉片的端粒酶電泳及活性檢測Fig. 2 Leaf telomerase activity and electrophoresis of C. camphora at different ages

2.3 不同高度葉片端粒酶檢測

香樟不同葉位高度的葉片采用的是新葉測定端粒酶活性，100 a香樟葉片從下到上的端粒酶活性分別為1.60，1.40，1.55和0.55（圖3）。莖基部的葉片端粒酶活性最高，莖頂端的端粒酶活性最低，可以得出隨著葉位高度的上升，端粒酶活性呈下降的趨勢，可能是由于葉片的生理年齡衰老導(dǎo)致。

圖 3 香樟不同葉位高度葉片的端粒酶電泳及活性檢測Fig. 3 Leaf telomerase activity and electrophoresis of C. camphora in different height

2.4 香樟新葉和老葉端粒酶檢測

香樟新葉和老葉在生理上分化時(shí)間不一致，導(dǎo)致其分化能力有差異。本研究對100 a香樟莖基部相同葉位高度的新葉和老葉進(jìn)行端粒酶電泳及活性測定，而且是從同一根枝條萌發(fā)的葉片。新葉的端粒酶活性為1.70和1.85，老葉的端粒酶活性為0.65和0.95，表明新葉的端粒酶活性顯著高于老葉（圖4）。

圖 4 香樟新葉和老葉端粒酶電泳及活性檢測Fig. 4 Leaf telomerase activities and electrophoresis in new and old leaves of C. camphora

2.5 香樟不同組織端粒酶檢測

為了檢測香樟不同組織的端粒酶活性差異，本試驗(yàn)選取了100 a香樟的種皮、莖干樹皮、枝條樹皮、老葉、嫩葉、葉芽、花芽和花8個(gè)不同組織測定端粒酶活性。端粒酶活性分別為1.25，1.15，1.30，0.65，1.56，1.85，1.95和1.10（圖5）。從圖中可以看出不同組織的端粒酶活性存在差異性，其中在葉芽和花芽組織中端粒酶活性較高，花芽的端粒酶活性在所有組織中最高，說明分化能力較強(qiáng)的幼嫩組織的端粒酶活性較高，而高度分化組織老葉的端粒酶活性最低。

圖 5 香樟不同組織的端粒酶電泳及活性檢測Fig. 5 Telomerase activity and electrophoresis in different tissues of C. camphora

3 結(jié)論與討論

目前植物端粒酶活性的主要檢測方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的端粒酶重復(fù)擴(kuò)增法（TRAP）[18]。不同植物TRAP方法測定端粒酶活性，PCR擴(kuò)增所使用的反向引物是RP，但先導(dǎo)引物不同。胡蘿卜端粒酶活性測定發(fā)現(xiàn)TS、GG和GGG三種先導(dǎo)引物PCR擴(kuò)增檢測效果較好[14]。銀杏端粒酶活性測定TS先導(dǎo)引物效果最好[9]。這種差異性可能與物種特異性有關(guān)。在本研究中，同一香樟葉片樣品用先導(dǎo)引物TS21比TS18能擴(kuò)增出更多的6 bp條帶，說明21 bp的引物更適合端粒酶活性的測定。這與前人的研究結(jié)果一致，TS21引物擴(kuò)增效果更好[14,19]。另外相對于其他引物，擴(kuò)增引物TS21和RP條帶最清晰，能明顯的檢測到6 bp的條帶，因此TS21和RP引物是最適合香樟端粒酶活性的測定。

衰老存在于大多數(shù)多細(xì)胞生物中，常常伴隨著端粒磨損，表觀遺傳改變，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失和細(xì)胞功能退化[20]。衰老與植物的生長和分化有關(guān)，而衰老則是最后一個(gè)階段，最終以死亡告終[21]。分生組織細(xì)胞具有無限復(fù)制的能力是樹種長壽的重要因素。狐尾松針葉端粒酶活性隨著樹齡的增加顯著降低[10]，銀杏葉片端粒酶活性隨著樹齡（10～700 a）的增加呈下降的趨勢[8-9]。本研究的香樟葉片的端粒酶活性得到類似的結(jié)果，隨樹齡（5～1 200 a）的增呈下降的趨勢。因此，端粒酶活性與林木植物的樹齡可能存在比較直接的負(fù)調(diào)控關(guān)系，在延長樹木壽命方面起著重要的作用。

不同植物、同一植物不同組織、同一植物不同分化程度的相同組織及不同環(huán)境條件下的相同部位端粒酶活性都可能存在差異[22]。端粒酶活性在農(nóng)作物和林木中研究比較多。在幼嫩組織和分化能力較強(qiáng)的組織端粒酶活性較高，在銀杏胚性愈傷組織[9]；女婁菜幼苗和根尖[11]；煙草（Nicotiana tabacum）愈傷組織[23]；大麥胚、花藥和心皮組織[12-13]；及大豆、菜花和胡蘿卜懸浮培養(yǎng)組織[14]中端粒酶活性都比較高。油松新葉的端粒酶活性都高于老葉[16]。因此端粒酶活性在生殖器官和愈傷組織細(xì)胞中較高，但在大多數(shù)營養(yǎng)器官中較低。在本研究中，香樟的8個(gè)不同組織的端粒酶活性分析得出葉芽和花芽端粒酶活性較高，其中花芽端粒酶活性最高，在老葉中活性最低。這與前人的研究結(jié)果相類似。這些結(jié)果表明，端粒酶活性對植物細(xì)胞的分化和增殖至關(guān)重要，分化能力較強(qiáng)的組織也具有較高水平的端粒酶活性，而高度分化的組織的端粒酶活性則較低。因此端粒酶活性可以作為衡量組織的分化增殖能力的指標(biāo)。目前在林木中端粒長度和端粒酶活性與不同葉位高度的關(guān)系研究比較少。Aronen和Ryyn?nen[24]研究指出歐洲赤松（Pinus sylvestris ）老樹（50～200 a）從樹干基部到頂端，莖形成層組織的端粒長度逐漸縮短，但端粒酶活性沒有檢測到變化。張徐俞等[8]指出油松和銀杏隨著葉位高度的上升，端粒酶活性逐漸增加。但在本研究中，香樟不同葉位高度從莖基部到頂端，葉片端粒酶活性呈下降的趨勢。樹木的這種端粒酶活性的差異性，可能是由于不同高度葉片的生理年齡不一樣導(dǎo)致的?？傊肆Ｃ富钚栽谥参矬w的各個(gè)組織都存在，不同生理年齡和分化能力組織的端粒酶活性都可能存在差異。