胃癌患者的端粒酶的表達

吳成舉 謝 鑫 柴紀嚴 陳 靖

遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032

端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能夠以自身的RNA為模板合成端粒DNA。人端粒酶結(jié)構(gòu)上主要包括三部分:①端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR);②端粒相關(guān)蛋白質(zhì)1(telomerase associated—protein 1，TP1/TLP1);③端粒酶催化亞單位 (human telomerase catalytic subunit，hTERT/hTRT)另外，還有熱休克蛋白、p23和dyskerin。

脊椎動物hTR二級結(jié)構(gòu)包括模板區(qū)、假結(jié)體區(qū)、CR4－5區(qū)、BoxH－ACA區(qū)和CR7區(qū)。Yeo等［1］研究發(fā)現(xiàn)模板區(qū)是端粒酶結(jié)合端粒DNA和發(fā)揮活性作用的必需結(jié)構(gòu)。Feng等［2］把MKN－45細胞hTR eDNA反式亞克隆至真核表達載體，發(fā)現(xiàn)MKN－45細胞的端粒酶活性受到顯著抑制，細胞凋亡增多。TP1并不是端粒酶發(fā)揮活性作用所必需的［3］。hTERT是包含氨基酸殘基的多態(tài)鏈，作為端粒酶的催化亞基具有逆轉(zhuǎn)錄酶的共同結(jié)構(gòu)。7個蛋白質(zhì)域以及端粒酶催化亞基獨特的T框架保守區(qū)域hTERT mRNA水平和端粒酶的活性呈正相關(guān)使hTERT基因突變，則細胞不表現(xiàn)端粒酶活性;將載有hTERT基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染端粒酶陰性的成纖維細胞，可重建端粒酶活性［4］。目前認為，hTERT是人類端粒酶活性的主要調(diào)控亞單位，hTERT一旦表達就和其它亞單位一起組裝成具有高活性的端粒酶全酶［5］。所以hTR和hTERT表達可以代表端粒酶的表達量。

1 材料與方法

1.1 標本是從遼寧中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科2006～2011年收集的，年齡 (50±7)歲，40例胃癌患者通過活檢分為:乳頭狀腺癌12例，管狀腺癌13例，低分化腺癌4例，印戒細胞癌6例，未分化癌5例;8例良性病變胃病患者通過活檢分為:胃炎2例、胃潰瘍4例、胃息肉2例。

1.2 檢測方法

取材:胃鏡檢查及活檢新鮮組織，每例均在胃鏡下鉗取病變部位組織的胃粘膜5塊，3塊送病檢，另2塊立即放人EP管中放在液氮罐中保存，取液氮活檢組織置于EP管中，迅速37℃融化后將組織塊減碎，加入2ml Trizon放置12h 4℃冰箱，加入氯仿放置20分鐘，取上清放入EP管中，分別加入異丙醇和乙醇放置20分鐘，離心4℃ 15000 r/min離心20 min棄上清，取lμl樣本沉淀加入79μlDEPC水，到A260/A280微量紫外分光光度計進行測定RNA的吸光度值。測定后，進行配置同濃度同體積的樣本，準備RT－PCR和PCR。

端粒酶擴增:50μl反映體系包含 ddH2O 35μl，10倍TRAP緩沖液 5μl，dNTP混合物 0.4μl，Tag DNA 聚合酶2μl，端粒酶 hTERT引物 5'－CATCCACATCGCGGCCACCACGT －3'，5'－ TGGTCTCCACGAGCCTCCGAGCG －3'5μl，內(nèi)參為β－actin引物 3μl，后按以下條件擴增:94℃ 30 S、50℃ 30 s、72℃ 90 s、循環(huán) 25次。最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物在2% 瓊脂糖電泳進行分析，用EB方法顯色，出現(xiàn)梯形條帶者為陽性。

2 結(jié)果

40例原發(fā)性胃癌組織中端粒酶hTERT，呈陽性表達39例，陽性率為97.5%(39/40)，8例良性胃部病變，端粒酶陽性表達者為1例，陽性率為12.5%(1/8)。胃癌的端粒酶陽性率明顯高于良性胃部病變的陽性率，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)(見圖)。

3 討論

胃癌是多種致癌基因、抑癌基因相互作用以及多個遺傳基因失去平衡的結(jié)果，這其中端粒酶的活化則是引起細胞永生，從而導致胃癌發(fā)生的重要和關(guān)鍵的步驟之一。有研究表明，端粒與細胞的壽命密切相關(guān)，端粒長度被認為是細胞有絲分裂的計數(shù)器，端?？s短很可能是正常細胞分裂與老化的分子信號。端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，其RNA是端粒合成的內(nèi)模板，端粒酶的功能即為添加端粒重復(fù)序列末端，阻止端粒隨細胞分裂而逐漸縮短，而如果端粒的長度得以維持，超過復(fù)制極限面無限制下去，細胞就會成為永生化或惡性轉(zhuǎn)化細胞。端粒酶的活化在在細胞癌變過程中起了關(guān)鍵性的作用。通過40例胃粘膜活檢組織標本端粒酶表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)胃癌活檢標本端粒酶陽性率為97.5% ，明顯高于非胃癌組，提示大多數(shù)胃癌組織端粒酶處于活化狀態(tài)，同時可見胃部病變8例病人，其中有1例是陽性，端粒酶可以作為病情進展和惡化的重要參考指標之一。

［1］Yeo M，Rha SY，Jeung HC，et al.FEBSLett，2005，579(1):127－132.

［2］Feng RH，Zhu ZG，Li JF，et al.World J Gastroenterol，2002，8(3):436－440.

［3］Liu Y，Snow BE，Hande MP，et al.Mol CellBiol，2000，20(21):8178－8184.

［4］Yudoh K，Matsuno H，Nakazawa F，et al.J Bone Miner Res，2001，16(8):1453－1464.

［5］Chang JT，Chen YL，Yang HT，et al.Eur J Biochem，2002，269(14):3442－3450.