端粒酶的研究進(jìn)展

惠子健

(山西醫(yī)科大學(xué),山西 太原 030001)

20世紀(jì) 30年代 Muller發(fā)現(xiàn)了保持染色體穩(wěn)定的端粒結(jié)構(gòu),1985年 Greider和 Blackburn在四膜蟲細(xì)胞提取物中發(fā)現(xiàn)了端粒酶,并證實(shí)端粒酶具有維持端粒長度的功能。1989年 Morin等人在宮頸癌的Hela細(xì)胞發(fā)現(xiàn)活化的人端粒酶,從此對端粒酶的研究便不斷深入,本文對端粒酶的研究進(jìn)展綜述如下。

1 端粒酶的結(jié)構(gòu)

端粒酶(Telomerase)又稱端粒末端轉(zhuǎn)移酶。目前認(rèn)為人端粒酶結(jié)構(gòu)上主要包括三種成分:端粒 RNA成分((human telomerase RNA component,hTR)、端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcip tase,hTERT)和端粒酶相關(guān)蛋白(TEP/TLP1/TP1)。在體外,僅有 hTR與 hTERT兩種成分就能表達(dá)出完整端粒酶的活性。

1.1 hTR

端粒酶的 RNA亞基(hTR)是合成端粒 DNA的模板,實(shí)驗證明它對端粒酶的結(jié)構(gòu)和催化活性都很重要[1～3]。人端粒酶RNA于 1995年被克隆成功,基因位于 3p 26.3[4],長度 445個核苷酸,為單拷貝基因,由 RNA聚合酶Ⅱ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,hTR模板序列為 5'-CUAACCCUAAC-3'[2],模板區(qū)序列與人端粒DNA序列互補(bǔ)。以端粒 3'-末端為引物,在端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶催化下,通過模板的滾動,特異合成端粒DNA,延長端粒。端粒酶RNA的序列和長度都有保守的二級結(jié)構(gòu),從 5'到 3'方向包含四個保守的雙螺旋,雙螺旋Ⅰ是最保守的區(qū)域,雙螺旋ⅡⅢ是莖環(huán)結(jié)構(gòu),這些保守的莖環(huán)通常是蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域,對保持端粒酶的功能十分重要[3]。Autexier[5]用小核核酸酶處理部分純化的人 293細(xì)胞所構(gòu)成的重組體系確定 hTR最小功能區(qū)位于44 nt～203nt,其中在 170 nt～179 nt,180 nt～189nt,190nt～199 nt間的突變均可使 hTR完全失活,提示這3個核苷酸區(qū)域?qū)TR活性是必須的,可能與端粒酶蛋白組分結(jié)合有關(guān)。

1.2 hTERT

端粒酶催化亞單位hTERT是具有反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)的組分[6]。1997年,Nakamura等克隆了人類端粒酶蛋白TP1(telomerase associated protein1)和 TP2(telomerase associated protein2)。其中TP1能與端粒酶RNA特異性結(jié)合,命名為端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。hTERT定位于5pl5.33,為單拷貝基因,其 cDNA也已被克隆。長度約為40 kb,可讀框的翻譯產(chǎn)物 hTERT分子量為127 kD,屬于逆轉(zhuǎn)錄酶超家族的亞群[7]。hTERT的表達(dá)與端粒酶活性呈正向相關(guān),端粒酶活性主要由 hTERT表達(dá)水平的高低決定[8～9]。因而認(rèn)為hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)節(jié)端粒酶活性的重要限速步驟之一[10]。目前研究證明hTERT為人端粒酶的催化亞基。

1.3 端粒酶相關(guān)蛋白

人類端粒酶相關(guān)蛋白于 1997年被克隆成功[11]。研究發(fā)現(xiàn),人端粒酶相關(guān)蛋白能夠協(xié)同端粒酶全酶的組裝,與端粒酶體內(nèi)活性有關(guān),在端粒酶的活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,因此,也被稱為端粒酶的調(diào)節(jié)亞基。但其在體內(nèi)對端粒酶活性和端粒長度保持并不是必需的。

2 端粒酶的生物學(xué)特性

在大多數(shù)人體正常組織或者細(xì)胞中,并不表達(dá)端粒酶活性,但少數(shù)有增殖潛能的細(xì)胞,如造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、免疫記憶細(xì)胞等有增殖潛能的細(xì)胞有低水平端粒酶表達(dá)。端粒酶能夠以自身的RNA為模版逆轉(zhuǎn)錄合成端粒 DNA重復(fù)序列并添加到端粒末端,以維持端粒長度,保持染色體的相對恒定[8]。端粒酶對端粒的延伸是精確調(diào)控的過程,是各個亞單位相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。首先,端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶被激活,進(jìn)而催化激活端粒酶;而后,端粒酶通過結(jié)合蛋白結(jié)合在 DNA的TG引物及端粒酶 RNA模板上,使端粒引物末端位于端粒酶 RNA模板區(qū)的起始端,然后開始合成端粒 DNA,進(jìn)行到模板區(qū)的末端時,延長的 DNA末端與RNA模板配對解開,但脫落的端粒仍然結(jié)合在端粒酶結(jié)合蛋白上,其末端又結(jié)合在端粒酶 RNA模板區(qū)的起始位,如此反復(fù)合成端粒,直到端粒達(dá)到一定長度后終止。

端粒酶不只是專一地合成端粒重復(fù)序列,已有一些實(shí)驗證實(shí)其具有其他功能如抗細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)等。

在不同的細(xì)胞系中端粒酶都有抗凋亡的作用[12]。在腫瘤細(xì)胞中,抑制端粒酶的活性能誘導(dǎo)腫瘤的凋亡,而且凋亡的出現(xiàn)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于端粒的明顯縮短[13]。正常的成纖維細(xì)胞表達(dá)端粒酶就能使細(xì)胞對凋亡和壞死更有抵抗力[14]。提示端粒酶在細(xì)胞抗凋亡過程中有很重要的作用。

端粒酶在DNA修復(fù)或抑制DNA破壞的過程中也起重要作用。在神經(jīng)細(xì)胞中,表達(dá) hTERT能保護(hù)細(xì)胞免受 DNA破壞因素引起的凋亡[15],Shnana.GG[16]等人的實(shí)驗顯示,外源性hTERT轉(zhuǎn)入不僅能夠使一些 DNA修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄活性增高,而且能夠通過提高dNTP的水平來維持染色體穩(wěn)定、提高DNA修復(fù)功能。

3 端粒酶活性的調(diào)節(jié)

由于端粒酶能夠調(diào)節(jié)端粒長度以及抗細(xì)胞調(diào)亡、DNA修復(fù)等的特殊功能,因此基于端粒酶活性調(diào)節(jié)的研究成為焦點(diǎn),分為誘導(dǎo)端粒酶活性與抑制端粒酶活性兩個方向。

3.1 誘導(dǎo)端粒酶活性

組織細(xì)胞工程學(xué)中,定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為各種組織細(xì)胞以及體外支架誘導(dǎo)細(xì)胞塑造人工器官研究越來越深入。因此增加端粒酶的活性,維持細(xì)胞分化和增殖能力,延長細(xì)胞的壽命抑制細(xì)胞衰老具有重要意義。目前的研究方法是將攜帶hTERT基因的載體轉(zhuǎn)染干細(xì)胞,激活端粒酶,使被轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞端粒酶活性升高。Sarin等[17]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠上皮組織表達(dá)TERT時,可以使毛發(fā)終止期的毛囊干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活躍期,小鼠長出了新長的毛發(fā)。Simonsen等[18]將外源性端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染人間充質(zhì)干細(xì)胞,誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化,轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞端粒酶活性增高,260個群體倍增水平后細(xì)胞還能繼續(xù)分裂,核型正常不致瘤,表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志,使細(xì)胞活力大大增強(qiáng)。Bodnar AG等[19]將編碼了人類端粒酶催化亞基的載體轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和包皮成纖維細(xì)胞中,這兩種細(xì)胞在正常人細(xì)胞中端粒酶表達(dá)呈陰性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶表達(dá)呈陰性的細(xì)胞的端?？s短、細(xì)胞衰老,而端粒酶表達(dá)呈陽性的細(xì)胞的端粒伸長,細(xì)胞分裂旺盛。這些端粒酶陽性細(xì)胞的壽命超出正常細(xì)胞的壽命 40倍,核形正常。

3.2 抑制端粒酶活性

研究發(fā)現(xiàn)80%以上的腫瘤組織端粒酶活化,雖然不是腫瘤發(fā)生的早期因素,但腫瘤中端粒酶的活化是腫瘤發(fā)生的一個重要步驟,而且與腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移和周期等相關(guān)。而正常組織中(包括正常干細(xì)胞)端粒酶的表達(dá)水平較低或只是暫時性表達(dá),且與腫瘤細(xì)胞相比端粒較長,因此基于抑制端粒酶活性的癌癥治療藥物成為可能。目前的研究方向主要集中在酶直接抑制劑、端粒酶主動免疫治療,以及干擾端粒酶反轉(zhuǎn)錄過程等幾個方面。已有大量綜述和論文報告端粒酶抑制劑的研究現(xiàn)狀,本文不再一一介紹。

有效和特異的小分子抑制劑至今尚未能找到[20]。端粒酶作為癌癥靶標(biāo)仍然處于臨床早期階段。人們還未能完全了解端粒酶的作用和其在正常生物學(xué)和癌癥病理生理學(xué)中的端粒動力學(xué),近期研究人員在部分腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了端粒延長的旁路途徑,使面臨的問題更加復(fù)雜化,目前臨床試驗中的藥物可能并不能通過最終驗證,無疑面臨著諸多挑戰(zhàn)與機(jī)遇。

4 問題與展望

綜上所述,目前對端粒酶的了解尚不充分,現(xiàn)有研究在闡明端粒酶的作用機(jī)理方面雖然取得了不少進(jìn)展[21～22],但在分子水平上對端粒酶的具體調(diào)控機(jī)制仍不明了,端粒酶活性變化的規(guī)律還有待揭示。因此研究仍處在起步階段,對端粒酶活性的調(diào)節(jié)還無法做到時間和活性的精確控制。但隨著研究的深入,端粒酶的秘密將逐漸被揭開。將對人類延緩衰老,治療疾病開辟出新的途徑。

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