地中海貧血的實驗室分子診斷技術研究進展

李繼慧 覃運榮 梁毅

地中海貧血（簡稱地貧）是世界上最常見的血紅蛋白病之一，主要是由于遺傳性珠蛋白基因缺失或點突變導致血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺失和/或不足而引起的貧血，也稱為珠蛋白生成障礙性貧血［1］。按照存在缺陷的珠蛋白基因的種類，地中海貧血一般可以分為α?、β?、δβ?和εγδβ?等類型，其中α?和β?地貧是最為常見的2種地貧類型［1］。地中海貧血好發(fā)于地中海、中東、南亞次大陸和東南亞等地區(qū)，在我國四川、云南、廣西、貴州、廣東等南部地區(qū)也較為常見［2］。地貧患者具有廣泛的臨床表現(xiàn)，可從幾乎無癥狀到需要終身輸血并伴隨多器官系統(tǒng)并發(fā)癥的重度貧血，并會遺傳給下一代，給家庭和社會帶來沉重的負擔［3］。目前對于地貧的治療一般是根據(jù)其類型采用相應的治療方案，而α?重型地貧（通常是指Hb?Bart's胎兒水腫綜合征）及β?重型地貧尚無有效、經(jīng)濟的治療方法［4?5］。因此使用經(jīng)濟、高效、準確的診斷方法及早對地貧進行篩查和判斷其類型，不僅有利于臨床對該病的治療，還能夠引導患者及時進行產(chǎn)前診斷，以避免重型地貧患兒的出生，對減緩家庭和社會壓力以及實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。本文將就目前地貧的實驗室分子診斷技術的研究進展進行綜述。

1 地中海貧血的分子診斷技術

根據(jù)地中海貧血的分子學機制，越來越多的分子診斷技術相繼被應用于臨床。據(jù)報道，多數(shù)α?地貧（約95%）及部分β地貧（約5%）是由于基因缺失引起的，這些缺失的傳統(tǒng)檢測方法是印記雜交技術（Southern blot），然而該技術操作繁瑣，費時費力，已被基于基因擴增的方法所代替［6］。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術是檢測缺失型地貧最常用的方法［7］。此外，多種以PCR為基礎的分子檢測技術可用于已知珠蛋白基因突變的地中海貧血的基因診斷，以及多種其他方法可用于未知突變的地中海貧血基因診斷［8］。

1.1 以PCR為基礎的分子診斷技術

1.1.1 裂隙聚合酶鏈反應

近年來，裂隙聚合酶鏈反應（gap polymerase chain reaction，Gap?PCR）技術已成為普遍應用于已知的、常見的缺失型α?地貧的檢測手段［9］。其原理是于缺失序列的兩端設計一對引物，在正常序列中這對上下游引物間距過遠，以至超出有效擴增范圍而不能生成擴增產(chǎn)物。大片段缺失的存在會使斷端連接，上下游引物靠近，可以生成特定長度的擴增產(chǎn)物［10］。α?地貧主要是由于不同長度的基因缺失導致的，可以優(yōu)先選擇Gap?PCR進行檢測［8］。唐笑等人［11］采用Gap?PCR法對湖南地區(qū)的7 914 例外周靜脈血標本進行α?地貧基因缺失檢測，檢出α地貧1 380例，檢出率為17.44%。戴慶福等人［12］對823例血常規(guī)指標異常的病人進行地貧基因檢測7，采用 Gap?PCR 檢測 3 種（??SEA、?α3.7、?α4.2）缺失型α?地中海貧血，結果1 225例為缺失型α?地中海貧血。Gilad等［9］也選擇Gap?PCR法檢測常見的缺失型α?地貧，并獲得較高的檢出率。上述研究團隊的結果都顯示了Gap?PCR法對于常見的缺失型α?地貧的檢測具有較高的臨床應用價值，是實驗室檢測常見的缺失型α?地貧的常用方法。

除了應用于缺失型α?地中海貧血基因檢測外，Gap?PCR法還能診斷一些大片段的β?地貧基因缺失［13］。然而，Gap?PCR 的結果判讀需進行瓊脂糖電泳，不但會造成實驗室核酸染料污染，而且電泳檢測通量非常低并難以自動化，難以應用于大樣本量檢測［14］。

1.1.2 反向斑點雜交技術

目前，已知的β?地中海貧血突變有200種以上，其中以單堿基替換、插入或缺失為主。一些大片段的β?基因缺失已經(jīng)被人們發(fā)現(xiàn)，這些大片段的缺失多數(shù)可用Gap?PCR法進行診斷［13］。而反向斑點雜交技術（reverse?dot?blotting，RBD），被廣泛應用于突變型β?地中海貧血的檢測，其原理是將擴增的DNA與固定在尼龍扎帶上的突變特異性探針雜交［8］。PCR擴增產(chǎn)物和探針通過分子雜交反應及顯色反應，觀察檢測膜條上各位點信號的有無，判斷該探針是否與PCR產(chǎn)物雜交，從而確定待檢樣品的基因型［12］。

1.1.3 其他PCR方法

除了Gap?PCR、反向斑點雜交技術外，多種以PCR技術為基礎的方法也得到了臨床應用。其中，高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)是一種高通量的突變篩選方法，是一種全新β?地中海貧血突變掃描和基因分析的遺傳分析方法，其特點是高特異性和高靈敏度，在大樣本、多突變位點篩查上比傳統(tǒng)非均一性方法更方便、性價比更高，相比定量探針法突變分析和其他類型快速突變分析法，應用面更廣，成本更低［15］。擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refracto?ry mutation system，ARMS）在一些實驗室中也得到應用，它快速、經(jīng)濟、方便地同時檢測多個突變［8］。

目前，基于PCR法的Gap?PCR和反向斑點雜交技術在臨床實驗室應用成熟，準確度高，且檢測成本相對較低，故已作為主流技術得到普及。但其也存在一些缺點，例如實驗過程產(chǎn)生污染，操作繁瑣，自動化程度低等，尤其是Gap?PCR和反向斑點雜交技術目前主要是針對已知的常見地貧類型的檢測，對于罕見型地貧等地貧類型檢出率低，對于未知類型地貧容易導致漏檢。

1.2 多重連接探針擴增技術（multiplex ligation?dependent probe amplification，MLPA）

MLPA是一種探針依賴擴增技術，僅需20～200 ng的DNA量，單管即可檢測多達50個位點的拷貝數(shù)變異［16］?；驹硎前涯康幕驈椭频揭蕾囂结樕希儆靡粚νㄓ靡飻U增捕獲到的目的片段，通過對擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析得出目的片段異常的結果。MLPA可快速的定量分析所檢測范圍內(nèi)的缺失或重復，且已被證明可以找到經(jīng)標準診斷儀器檢測尚不能找到的已知或者未知的缺失［17］。

對于未知突變的α?地貧，仍有部分實驗室在使用印記雜交技術；然而MLPA逐漸取代了Southern印記雜交技術，原因是其高靈敏度、高可靠性，且無需使用放射性方法等優(yōu)點［18］。Yuregir等人［19］對 30名血液學參數(shù)提示為α?地貧而傳統(tǒng)的反向斑點雜交技術（RDB）檢測結果為陰性的病人使用MLPA技術檢測，結果發(fā)現(xiàn)，30名病人中有3人（10%）存在α?珠蛋白基因缺失。Gilad等［9］的研究也發(fā)現(xiàn)采用Gap?PCR法檢測常見缺失型α?地貧，聯(lián)合使用MLPA技術檢測罕見地貧可提高地貧檢出率。由此可見，與常規(guī)的基于PCR的技術相比，MLPA對于罕見或未知類型的缺失型α?地貧有著更高的檢出率。雖然MLPA技術對于突變型地貧的應用有較大的局限性，但如果將常規(guī)檢測方法與MLPA技術聯(lián)合使用，就能在一定程度上彌補常規(guī)檢測方法在罕見或未知缺失型α?地貧類型上的空缺，提高檢測的準確率，減少漏檢的可能。

1.3 基因芯片技術

基因芯片技術的原理是將大量的寡核苷酸片段或DNA片段有序排列在固相載體上，稱之為基因芯片或DNA陣列，同時提取待測樣品DNA，與芯片雜交，然后掃描芯片的熒光強度，應用生物信息學分析結果，最后得到樣品中基因序列和表達水平的相關信息。王沙燕等［20］采用基因芯片技術對40例標本進行β?地貧基因檢測，結果29例檢測出為β?地貧的患者，7例為雙重雜合子或純合子。陳林興等［21］對經(jīng)初篩為β?地貧的32例患者進行基因芯片檢測，并與斑點雜交法進行比較分析，結果基因芯片檢出32例β?地貧，斑點雜交法檢出30例，他們認為基因芯片法具有快速、高效、自動化程度高且簡便等優(yōu)點，提倡推廣應用。區(qū)小冰等［22］應用基因芯片技術對62例初篩診斷為α?地貧，93例初篩診斷為β?地貧（輕型60例，重型33例）的患兒血樣標本進行α及β珠蛋白的基因分析，結果成功檢測出中國人中常見的3種缺失型α?地貧，2種非缺失型α?地貧（HbCS，HbQS）的雜合子、純合子及雙重雜合子。在60例輕型β?地貧，33例重型β地貧的126條染色體中共檢測到8種突變類型；在60例β?地貧雜合子中檢測到8例（13.3%）及33例重型β?地貧中檢測到2例（6%）同時復合有α?地貧基因，可見，相對于常規(guī)的基于PCR的技術來說，基因芯片技術不僅可以同時檢測α?與β?地貧，具有更高的效率，且自動化程度高。然而，基因芯片技術雖然具有較大的優(yōu)勢，但其作為一種新興技術應用在地中海貧血檢測方面尚不夠成熟，較高的檢測成本目前也限制其在臨床上的大規(guī)模推廣應用。

1.4 高通量測序

繼Sanger測序之后，二代測序（next?generation sequencing，NGS）將測序能力從幾百個堿基對增加到數(shù)千個。NGS基于對克隆擴增的DNA分子大規(guī)模并行測序，再加上足夠的計算能力和相應的軟件進行有效的數(shù)據(jù)分析，將基因診斷以可承受的價格引入臨床實踐［23］。它可以應用于整個基因組、全外顯子組，以及全基因組的特殊目的范圍［23］。

宋春林等［24］以1 368例疑似地中海貧血患者為研究對象，采用二代高通量測序儀進行地中海貧血基因檢測，同時以Gap?PCR和RDB?PCR方法檢測常見地貧突變，以Sanger測序驗證，結果共檢出523例（38.2%）共25種地貧基因突變，使用常規(guī)基因檢測方法陰性而NGS測序陽性的標本，經(jīng)Sanger測序驗證與NGS結果一致，他們認為高通量測序在地貧檢測上值得推廣。

然而也有報道稱目前文獻中未發(fā)現(xiàn)NGS技術有可用的珠蛋白基因測序數(shù)據(jù)［8］?？梢奛GS技術用于地中海貧血的基因診斷還缺少大量的研究驗證。

2 小結

地中海貧血是最常見的具有遺傳性的血紅蛋白病之一，危害著人類健康，也影響了新生人口的素質(zhì)。隨著醫(yī)療水平的不斷提高，地中海貧血的檢測技術在不斷的提升。實驗室對于常見的α?地貧及β?地貧基因檢測技術主要是基于PCR法的Gap?PCR和反向斑點雜交技術，但這些常規(guī)技術也存在一定的局限性，影響著地貧的檢出率。隨著科技的發(fā)展，地中海貧血的致病分子機制不斷被發(fā)現(xiàn)，各種新技術也隨之發(fā)展起來，以提高地貧的檢出率，如多重連接探針擴增技術、基因芯片技術、高通量測序等技術。而每種技術都有各自的優(yōu)缺點，如MLPA主要是用來檢測缺失型的地貧類型，檢測效率較快，成本相對較低，但對于突變型地貧的應用則有較大的局限性；基因芯片及高通量測序的檢測深度較高，但同時成本也較高，不適用于大規(guī)模的臨床推廣使用，且基因芯片及高通量測序技術在地貧基因檢測上的應用尚不夠成熟，在該方面的應用價值還有待更多考究。目前國內(nèi)多個地中海貧血高發(fā)地區(qū)享有政府的地貧基因檢測補助，尤其是產(chǎn)前診斷，當使用常規(guī)的基于PCR法技術來檢測時，病人自費比例可以降到很低，甚至免費；而若采用其他方法，特別是基因芯片或高通量測序技術，則產(chǎn)生費用過高而增加病人的負擔，病人的依從性可能降低，從而降低了病人的檢測積極性，不利于引導地貧患者的產(chǎn)前診斷遺傳咨詢。此外，是否有必要對病人進行常見的α?地貧及β?地貧基因以外的地貧基因檢測也仍有待探討。新興的技術目前或許還不能取代常規(guī)的基于PCR法的檢測技術，但可以作為常規(guī)技術的一種補充，彌補常規(guī)技術的不足。因此，充分了解每種技術的應用范圍及局限性，結合各自實驗室的具體情況，尋找到準確、高效、經(jīng)濟的診斷方案，對于各高發(fā)地區(qū)預防中重型地中海貧血患兒的出生及提高新生人口素質(zhì)具有積極且深遠的意義。

參考文獻

［1］Martin A，Thompson A A.Thalassemias［J］.Pediatr Clin North Am，2013，60（6）：1383?1391.

［2］杜萌，朱寶生，呂濤.地中海貧血致病機制及基因治療進展［J］.醫(yī)學動物防制，2017，33（1）：58?61.

［3］Weatherall DJ.Thalassemias［J］.Brenner's Encyclope?dia of Genetics，2013，7（2）：60?62.

［4］Piel FB ，Weatherall DJ.The alpha?thalassemias［J］.N Engl J Med，2014，371（20）：1908?1916.

［5］Joly P，Pondarre C，Badens C.Beta?thalassemias：mo?lecular，epidemiological，diagnostical and clinical as?pects［J］.Ann Biol Clin（Paris），2014，72（6）：639?668.

［6］Greene DN，Vaughn CP，Crews BO，et al.Advances in detection of hemoglobinopathies［J］.Clinica Chimi?ca Acta，2015，439（2015）：50?57.

［7］Kho SL，Chua KH，George E，et al.A novel gap?PCR with high resolution melting analysis for the detection of α?thalassaemia Southeast Asian and Filipino β0?thal?assaemia deletion［J］.Scientific Reporpts，2015，5：13937.

［8］Brancaleoni V，di Pierro E，Motta I，et al.Laboratory diagnosis of thalassemia［J］.IntJnlLabHem，2016，38（S1）：32?40.

［9］Gilad O，Shemer OS，Dgany O，et al.Molecular diag?nosis of α ?thalassemia in a multiethnic population［J］.Eur J Haematol，2017，98（6）：553?562.

［10］秦丹卿，何天文，尹愛華.地中海貧血產(chǎn)前基因診斷技術的臨床應用［J］.分子診斷與治療雜志，2017，9（4）：223?227.

［11］唐笑，劉岱璿，周梅華.湖南地區(qū)地中海貧血基因檢測結果及突變類型分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（4）：32?33.

［12］戴慶福，李曉璐，王玉霞，等.中國福建省龍巖地區(qū)地中海貧血基因突變類型的分析［J］.中國實驗血液學雜志，2017，25（2）：498?502.

［13］Higgs DR，Engel JD，Stamatoyannopoulos G.Thal?assaemia［J］.Lancet，2012，379（9813）：373?383.

［14］駱明勇，胡聽聽，王繼成，等.PCR?RDB的地中海貧血基因復合型檢測方法的臨床應用［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（4）：22?24.

［15］唐娟，張崇林，蔣群芳，等.地中海貧血基因診斷技術進展及無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（12）：5?6.

［16］Lescoat D，Jouan H，Loeuillet?Olivio L，et al.Fluores?cent in situ hybridization（FISH）on paraffin?embedded placental tissues as an adjunct for understanding the eti?ology of early spontaneous abortion［J］.Prenat.Diagn，2005，25（4）：314?317.

［17］Harteveld CL，Voskamp A，Phylipsen M，et al.Nine unknown rearrangements in 16p 13.3 and 11p 15.4 caus?ing alpha?and beta?thalassaemia characterised by high resolution multiplex ligation dependent probe amplifica?tion［J］.J Med Genet，2006，42（12）：922?931.

［18］Harteveld CL.State of the art and new developments in molecular diagnostics for haemoglobinopathies in multi?ethnic societies［J］.Int J Lab Hematol，2014，36（1）：1?12.

［19］Yuregir OO，Ayaz A，Yalcintepe S，et al.Detection of a?thalassemia by using multiplex ligation dependent probe amplification as an additional method for rare mu?tations in Southern Turkey［J］.Indian J Hematol Blood Transfus，2016，32（4）：454?459.

［20］王沙燕，蔡佩欣，張阮章，等.基因芯片用于檢測β地中海貧血［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，23（12）：5?6.

［21］陳林興，鄭慶棠，陳澤欽.β地中海貧血的基因芯片檢測［J］.國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2005，26（7）：409?410.

［22］區(qū)小冰，張力，余一平，等.基因芯片診斷地中海貧血的研究［J］.中華兒科雜志，2005，43（1）：33?34.

［23］Lohmann K，Klein C.Next generation sequencing and the future of genetic diagnosis［J］.Neurotherapeutics，2014，11（4）：699?707.

［24］宋春林，劉正平，陳淑芬，等.二代高通量測序儀在大規(guī)模地中海貧血基因檢測的應用價值［J］.中國醫(yī)療設備，2016，31（S1）：15.