血清表面抗原檢測(cè)可能并非評(píng)價(jià)直接抗乙肝病毒藥物臨床效果的最好指標(biāo)

魯鳳民

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）病毒感染仍是全球及我國慢性肝病的重要病因［1］。乙型肝炎病毒（hepatitis B Virus，HBV）DNA的存在形式主要有疏松開鏈環(huán)狀DNA（rc?DNA）、共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。以不完全雙鏈DNA形式存在的rc?DNA存在于具有感染性的Dane顆粒的核衣殼內(nèi)，是成熟的乙肝病毒的主要存在形式。cccDNA存在于感染肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，為病毒復(fù)制的模板。cccDNA的持續(xù)存在和活躍轉(zhuǎn)錄是HBV慢性感染的病毒學(xué)基礎(chǔ)，由于現(xiàn)有抗乙肝病毒藥物對(duì)cccDNA無直接破壞作用，如何徹底治愈CHB仍是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。

HBV的基因組有S、C、P和X共4個(gè)部分重疊的基因編碼區(qū)，分別編碼表面抗原、e抗原和核心抗原、DNA聚合酶（p蛋白）及X蛋白等。其中S區(qū)又可劃分為前 S1（Pre?S1）、前 S2（Pre?S2）和 S 基因，對(duì)應(yīng)編碼L、M和S 3種HBV包膜蛋白，三者羧基端完全一致，統(tǒng)稱 HBsAg［2］。HBsAg 是病毒膜蛋白，既可存在于Dane顆粒表面，也是構(gòu)成管形和小球形亞病毒顆粒的主要成分。HBsAg是最早被用于急/慢性HBV感染診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，在實(shí)現(xiàn)了血清HBsAg定量檢測(cè)的同時(shí)，檢測(cè)靈敏度也不斷提高（檢測(cè)下限已達(dá)0.05 IU/mL）。定量檢測(cè)試劑的臨床應(yīng)用為我們打開了一扇新窗，可以觀察抗病毒治療下血清HBsAg的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義，大量的臨床試驗(yàn)業(yè)已證實(shí)，與基線水平相比，血清HBsAg的快速下降往往預(yù)示著良好的病毒學(xué)應(yīng)答［3?4］。

臨床上多將肝功能恢復(fù)正常、HBsAg消失和/或抗?HBs陽轉(zhuǎn)、血清DNA低于檢出限稱為“功能性治愈（functional cure）”［5］。我國學(xué)者將之稱為臨床治愈（clinical cure）。當(dāng)患者出現(xiàn)HBsAg消失和/或抗?HBs陽轉(zhuǎn)時(shí)，其肝組織內(nèi)的cccDNA往往消失或失去轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)發(fā)生血清HBsAg消失后，患者停藥后發(fā)生HBV DNA反彈和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)大為降低。不僅如此，這些臨床治愈患者的終末期肝病和肝癌的發(fā)生率明顯減少［6］。因此，表面抗原消失被認(rèn)為是一個(gè)理想的治療終點(diǎn)。遺憾的是，現(xiàn)有藥物特別是核苷（酸）類（nucleos（t）ide analogues，NA）藥物治療的慢性乙肝患者HBsAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)的發(fā)生率很低，僅為每年0.5%～1%［7］，大多數(shù)患者不得不終身用藥［8］。由于長期使用有副作用之虞，長效干擾素的臨床方案多為48周的有限療程，停藥后總的表面抗原累計(jì)消失率（3%～7%）雖然略高于NA類藥物［9］，但同樣并不理想。

最近在Lok和Zoulim等4位教授［10］所領(lǐng)導(dǎo)起草的針對(duì)目前慢性乙肝治愈的專家意見里，在提到既往的完全治愈（complete sterilizing cure，指血清中檢測(cè)不到HBsAg，及肝組織內(nèi)包括cccDNA和整合DNA的HBV DNA完全清除）難以實(shí)現(xiàn)的共識(shí)基礎(chǔ)上，對(duì)功能性治愈（functional cure）也進(jìn)行了討論。多數(shù)專家對(duì)功能性治愈定義為：在限定療程內(nèi)，在消除殘余肝損傷和降低肝細(xì)胞癌風(fēng)險(xiǎn)基礎(chǔ)上的血清中HBsAg和HBV DNA的持續(xù)消失，可伴有或不伴有血清學(xué)轉(zhuǎn)換（抗?HBs的陽轉(zhuǎn)）。文中特別提到，部分專家認(rèn)為功能性治愈還應(yīng)有cccDNA轉(zhuǎn)錄的完全靜止、cccDNA的清除（有別于整合DNA的清除）、徹底消除肝損傷和解除肝癌風(fēng)險(xiǎn)。不論是完全治愈或者功能性治愈，血清HBsAg的消失都是實(shí)驗(yàn)室判定的最重要指標(biāo)。

一般而言，血清中的HBsAg主要來自肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA。但近年來的研究顯示，整合的HBV DNA 也會(huì)轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生 HBsAg［11］。HBV DNA的整合在慢性乙肝患者中廣泛存在，如Ma?son實(shí)驗(yàn)室最近的報(bào)道表明，HBV DNA整合大量存在于CHB患者的肝細(xì)胞中，患者最多可有上億的肝細(xì)胞帶有整合病毒DNA片段［12］。目前已知，雙鏈線性HBV DNA（dsl?DNA）是病毒整合至宿主基因組的主要來源，其產(chǎn)生與作為正鏈合成起始引物的前基因組RNA（pgRNA）殘端未發(fā)生正確的跳轉(zhuǎn)，而在原位起始聚合酶鏈反應(yīng)形成大小約3.2 kb的雙鏈線性DNA有關(guān)［13］。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，整合的HBV DNA并不參與病毒的復(fù)制過程，而只是HBV感染過程中的隨機(jī)事件。眾多的研究結(jié)果顯示，整合病毒DNA片段的斷點(diǎn)大都位于病毒基因組的DR1和DR2區(qū)域，多保留了完整的編碼 HBsAg 的 S 基因區(qū)［11，14］。由于 HBeAg 陰性CHB患者病程較HBeAg陽性患者長，發(fā)生整合的概率也更大、更加廣泛［15］?？紤]到整合的HBV DNA同樣能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBsAg，可以認(rèn)為，在HBeAg陰性CHB患者中，其血清HBsAg水平對(duì)病毒復(fù)制水平的指示意義并不大。對(duì)于長期接受NA藥物治療的患者，尤其是HBeAg轉(zhuǎn)陰后，血清中低水平的HBsAg可能來自于整合型HBV DNA的持續(xù)表達(dá)，與病毒載量無關(guān)，不能提示肝細(xì)胞核內(nèi)存在有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA［16］。由此可見，以血清HBsAg的持續(xù)消失作為功能性治愈或臨床治愈的判定標(biāo)準(zhǔn)，可能會(huì)使一些經(jīng)過長時(shí)間NA類藥物抗病毒治療后，肝組織內(nèi)cccDNA已經(jīng)耗竭或轉(zhuǎn)錄已經(jīng)完全靜默的慢性乙肝患者不得不繼續(xù)接受長期甚或終生的抗病毒治療。而實(shí)際上，這些患者體內(nèi)往往并無HBV病毒復(fù)制?？赡苁强紤]到了這一現(xiàn)象或問題，也是基于HBsAg消失率過低影響新的抗病毒藥物研發(fā)的考量，在Lok教授等的專家意見中，也有人提出了“部分治愈”（partial cure）的概念。即經(jīng)過一定療程的治療，患者血清HBV DNA 持續(xù)檢測(cè)不到，但 HBsAg陽性［10］。很顯然，現(xiàn)有的新一代核苷（酸）類藥物通過抑制病毒P蛋白的逆轉(zhuǎn)錄活性和DNA聚合酶活性，可以很容易地使血清中的rc?DNA水平快速下降到檢測(cè)不到的水平。但此時(shí)患者肝組織內(nèi)的cccDNA仍在活躍復(fù)制，血清中存在大量的核衣殼內(nèi)病毒核酸為pgRNA及其變異剪接體的病毒樣顆粒，或者核衣殼為空心的顆粒。此時(shí)，肝臟因病毒仍在活躍復(fù)制而帶來的免疫病理損傷可能并未有很好的緩解。來自我國的一項(xiàng)研究顯示，在接受NA類藥物治療的慢性乙肝患者，其血清中HBV RNA的水平與患者肝組織的炎性損傷有密切關(guān)系［17］。要實(shí)現(xiàn)真正意義上的“部分治愈”，除了病毒DNA檢測(cè)不到、炎癥損傷得到控制外，還需保證停藥后病毒不反彈。在停藥前能夠準(zhǔn)確預(yù)判哪位患者不會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)反彈，實(shí)現(xiàn)安全停藥，現(xiàn)階段仍是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

由于整合的HBV基因組全長僅有3.2 kb，故3.5 kb長的pgRNA不可能來源于整合的HBV片段，只能由cccDNA直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。相比血清HB?sAg水平，血清HBV RNA能夠更好地反映肝組織cccDNA的活性。我們實(shí)驗(yàn)室近期通過一個(gè)小樣本的回顧性臨床研究顯示，接受NA治療的CHB患者停藥點(diǎn)血清HBV RNA的檢測(cè)結(jié)果確實(shí)與停藥后病毒學(xué)反彈發(fā)生率密切相關(guān)，即停藥點(diǎn)血清HBV RNA未檢出的患者發(fā)生反彈的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低［18］。據(jù)此，我們提出了“安全停藥”建議，即對(duì)鞏固治療后達(dá)到現(xiàn)指南停藥標(biāo)準(zhǔn)的患者，加測(cè)血清HBV RNA，如果持續(xù)陰性，停藥后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)大為下降。當(dāng)然，這一指標(biāo)在進(jìn)入臨床并廣泛應(yīng)用之前，還需通過大樣本的前瞻性研究。血清HBV RNA作為病毒活躍復(fù)制的指標(biāo)，其意義可能不僅局限于停藥預(yù)測(cè)?？紤]到血清HBV RNA能夠較好地反映肝組織cccDNA的活性，我們把經(jīng)過長期NA藥物治療后的cccDNA清除或者處于持續(xù)靜默，且血清HBsAg低值陽性這一接近于臨床治愈的狀態(tài)稱為“準(zhǔn)臨床治愈”（para?functional cure），以有別于HBsAg消失（伴有或不伴有抗?HBs陽轉(zhuǎn)）的“臨床治愈”或“功能性治愈”［19］。和部分學(xué)者提出的部分治愈不同，準(zhǔn)臨床治愈可以通過檢測(cè)血清中的HBV RNA來進(jìn)行判定，使之具有臨床實(shí)踐操作的可行性。建議在未來藥物的臨床療效評(píng)價(jià)中，將之作為一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

最后，需要強(qiáng)調(diào)的是，HBV DNA的高頻整合也與肝癌發(fā)生密切相關(guān)［20］。HBV DNA整合入宿主的基因組，通過插入突變破壞宿主基因組的功能或影響其調(diào)控［21?22］，是 HBV 感染重要的直接致癌機(jī)制之一。臨床數(shù)據(jù)也顯示，通過抗病毒治療使患者實(shí)現(xiàn)血清HBsAg清除后，發(fā)生HCC的風(fēng)險(xiǎn)則可明顯減少。因此，研發(fā)新藥，實(shí)現(xiàn)慢性乙肝的臨床治愈乃是我們不懈的追求。

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