抗真菌藥物及其耐藥機制研究進展

王光裕，楊英，車寶泉，李文東，王升啟

1.軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所，北京100850；2.北京市藥品檢驗所，北京100035

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展與醫(yī)療水平的提高，人們得以對以前無法治愈的疾病加以控制。伴隨大量抗腫瘤化療藥物、免疫制劑及激素的使用，雖然延長了人們的壽命，但也使患者的內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)失調(diào)的可能性增加，從而給了侵襲性真菌可乘之機，對于艾滋病等免疫缺陷病患者、骨髓移植和器官移植患者，其真菌感染率也大大增加[1-2]。此外，近年來不斷有新發(fā)真菌病原體侵襲人類的報道[3-4]，也引發(fā)了國際關(guān)注。有研究表明，侵襲性真菌感染患者的死亡率超過50%[5-6]，因此，采用合適的抗真菌藥物至關(guān)重要。但是臨床用藥狀況表明，越來越多的真菌感染顯示對傳統(tǒng)抗真菌藥物的耐藥性，嚴重影響患者的恢復(fù)，這就促使人們對其耐藥機制進行研究，以期改良傳統(tǒng)藥物或發(fā)現(xiàn)新的抗真菌藥物。

臨床常見的真菌感染多為條件致病菌，一般在伴隨感染或患者免疫力低下時發(fā)病。依據(jù)真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，主要分為以下幾類：①酵母菌屬，包括念珠菌（白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌等）和非念珠菌（包括隱球菌、毛孢子菌等）；②霉菌屬，包括曲霉菌（煙曲霉、黃曲霉、土曲霉等）和非曲霉（結(jié)合菌、暗色孢霉菌、青霉菌等）；③雙相真菌，包括馬爾尼菲藍狀菌、副球孢子菌和組織胞漿菌等；④類真菌，包括肺孢子菌、奴卡菌、放線菌等[7]。

1 常見抗真菌藥物

針對真菌生長增殖的各個過程，不同抗真菌藥物有不同的作用機理，基于藥物的化學結(jié)構(gòu)，可以分為以下幾類。

1.1 多烯類抗真菌藥

包括兩性霉素B 以及制霉菌素，其通過結(jié)合真菌細胞膜上的麥角固醇，形成甾醇-多烯復(fù)合物，從而在細胞膜上形成親水通道，增加陽離子通透性，致使細胞膜內(nèi)外離子梯度變化，內(nèi)容物外泄，造成真菌死亡[8-9]。人細胞膜上膽固醇與麥角固醇結(jié)構(gòu)類似，當腎小球濾過率降低時，服用多烯類藥物會對人體顯示腎毒性。

1.2 吡咯類抗真菌藥

又稱氮唑類抗真菌藥物，包括咪唑類和三氮唑類。咪唑類常用藥物有咪康唑和酮康唑，但毒副作用大，一般僅外用；三氮唑類的常用藥物有氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑等[10]。該類藥物作用機制和多烯類不同。真菌細胞色素P-450 能夠催化羊毛固醇14 位脫α甲基成為真菌細胞膜上的重要成分麥角固醇，吡咯類藥物通過和細胞色素P-450 結(jié)合來抑制羊毛固醇去甲基酶（CYP51）,導致羊毛固醇不能有效合成，破壞細胞膜的滲透性，繼而造成真菌死亡[11-12]。有研究顯示，伏立康唑可以穿透血腦屏障，因此，可以用來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染[13]。

1.3 環(huán)狀酯肽類抗真菌藥

又稱棘白菌素類抗真菌藥，常見臨床用藥為卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈。該類藥物主要通過破壞細胞壁發(fā)揮藥效。1，3-葡聚糖是真菌細胞壁的重要組分，由1，3-葡聚糖合成酶催化合成，棘白菌素通過非競爭抑制真菌1，3-葡聚糖合成酶，抑制細胞壁的1，3-葡聚糖合成，破壞真菌細胞壁的結(jié)構(gòu)，達到抑制并殺滅真菌的目的[14]。由于哺乳動物細胞內(nèi)并不存在該酶，因此，該類藥物并不會對人體有毒性作用[15]。

1.4 核酸抑制類抗真菌藥

常見臨床用藥為5-氟胞嘧啶（5-FC），其依靠胞嘧啶通透酶進入真菌細胞，經(jīng)胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)變成氟尿嘧啶，之后轉(zhuǎn)變成氟尿苷三磷酸，整合到真菌RNA 中，從而阻斷蛋白質(zhì)的合成；此外，5-FC 還能夠轉(zhuǎn)變成氟脫氧尿苷磷酸，競爭性抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，影響DNA 的合成，從而抑制真菌細胞的生長。臨床治療中發(fā)現(xiàn)5-FC 具有腎毒性和骨髓抑制的副作用，因此，在使用時必須控制其血藥濃度[16]。此外，同伏立康唑一樣，5-FC 也可以穿透血腦屏障，可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的真菌感染[12]。

1.5 烯丙胺類抗真菌藥物

常見臨床用藥為特比萘芬、萘替芬等，是從雜環(huán)螺旋萘衍生出來的廣譜高效低毒抗真菌藥，通過抑制鯊烯環(huán)氧合酶，導致鯊烯的堆積，同時，細胞膜麥角固醇的合成也受到抑制[17-18]。

1.6 其他抗真菌藥物

以上幾種為抗真菌常用藥。此外，從木槿馬杜拉放線菌中分離得到的普那米星在鈣離子存在的條件下可與甘露聚糖結(jié)合，改變其空間結(jié)構(gòu)，從而破壞細胞壁，導致菌體死亡[19]。由鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類天然抗生素抗霉素A 能夠與真菌細胞內(nèi)線粒體的電子傳遞體系結(jié)合，嚴重阻礙由輔酶Q 向細胞色素C 的電子傳遞，從而起到殺菌作用[20]。中藥組分黃芩苷，可能通過抑制白念珠菌DNA 生物合成達到抗菌作用[21]。

2 真菌的耐藥機制

真菌可通過一系列方法減弱或避免藥物的作用，從而達到抗藥目的。

2.1 改變藥物靶向分子

一種方式是改變藥物靶向蛋白的結(jié)構(gòu)，降低藥物敏感性，從而使藥物失效。ERG11基因編碼羊毛固醇去甲基酶CYP51，該基因突變致使酶的氨基酸序列改變，當突變位點為吡咯類藥物的結(jié)合位點時，藥物無法與酶結(jié)合，從而喪失藥效。另一種方式是過量表達藥物靶向蛋白，使藥物不能完全發(fā)揮作用[22]。

2.2 降低菌體內(nèi)藥物濃度

一方面，通過降低細胞通透性，使藥物進入細胞的量減少；另一方面，細胞膜外排泵表達增加，從而加速將藥物排到胞外。真菌外排泵主要包括ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ABCT）超家族和異化擴散載體（MFS）超家族。ABCT 通過ATP 供能將藥物排到胞外，白念珠菌的ABCT 相關(guān)蛋白為CDR1 和CDR2，是將吡咯類藥物外排的最主要ABCT。MFS 超家族利用細胞內(nèi)外的氫離子濃度差產(chǎn)生的電化學勢能對藥物分子進行被動運輸，其相關(guān)載體基因為MDR1等，通過基因擴增、轉(zhuǎn)錄增強、mRNA 分解抑制來上調(diào)mRNA 的表達，從而誘導耐藥[23]。真菌細胞胞嘧啶通透酶活性降低能夠減少對5-FC 的攝取，從而出現(xiàn)耐藥[24]。

2.3 改變代謝途徑

抗真菌藥物可以通過抑制真菌代謝關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵物質(zhì)合成來發(fā)揮抑菌作用，如吡咯藥物抑制14α-甲基-3，6-二醇轉(zhuǎn)化為麥角固醇，但是當EGR3基因突 變時，14α-甲基-3，6-二醇 被14α-甲基甾醇代替，14α-甲基甾醇可以部分行使麥角固醇的功能，從而達到耐藥效果[25]。此外，真菌還可以抑制5-FC 代謝為毒性物質(zhì)的關(guān)鍵酶（UPRTase）誘導耐藥[26]。

2.4 形成生物膜

生物膜是真菌形成群落后分泌于胞外并包裹在真菌表面的多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于其具有天然屏障作用，所以會影響藥物作用于菌體；另一方面，形成生物膜后菌體生長緩慢，從而也限制了和外界的物質(zhì)交換，降低藥物攝??；此外，有研究表明，該狀態(tài)菌體會有耐藥基因的表達[27-28]。

2.5 細胞壁的適應(yīng)性改變

FKS1 蛋白是葡聚糖合成酶復(fù)合物的催化亞基，其編碼基因（尤其是HS1 和HS2 區(qū)）突變，很有可能致使對棘白菌素的敏感性降低，有研究表明，自發(fā)突變所致FKS1 多態(tài)性與白念珠菌對棘白菌素的藥物敏感性降低有關(guān)[29-30]。

3 對抗真菌耐藥的方案

3.1 對原有藥物進行化學修飾

對于棘白菌素類，Singh 等以羥基谷氨酰胺替換蘇氨酸、以芳香族雜環(huán)的酰基側(cè)鏈替換環(huán)六肽分子獲得的新型藥物具有低毒高效抗菌活性[31]。對于氟康唑，有研究顯示，一方面可以對其醇羥基酯化，另一方面可以利用三唑環(huán)N 原子形成季銨鹽化合物，其抗菌活性都得到明顯提高[32-33]。

3.2 開發(fā)新型結(jié)構(gòu)的藥物

Viamet Pharmaceuticals 公司研發(fā)了對真菌具有更高選擇性的VT-1161、VT-1129、VT-1598 等四氮唑類藥物[34]。VT-1161 對白念珠菌的CYP51具有高親和力，因此具有比常規(guī)氮唑類藥物更高的選擇性[35]；VT-1129 具有類似的基本骨架，主要對隱球菌產(chǎn)生抑制作用[36]；VT-1598 對酵母菌、絲狀真菌，甚至超級真菌——耳念珠菌都具有較強的抑制作用[37-38]。

3.3 開發(fā)新劑型

多烯類藥物對人體毒性大，因而限制了其應(yīng)用。通過開發(fā)新劑型，如脂質(zhì)體藥物、納米球藥物等，可以顯著降低藥物毒性。如兩性霉素B 做成脂質(zhì)體，能結(jié)合麥角固醇，但腎毒性大大降低，目前已有上市藥物。兩性霉素B/聚乙二醇-聚谷氨酰胺芐酯納米球能夠顯著降低兩性霉素的毒性，目前還處于研發(fā)階段[39-40]。

3.4 采用中藥制劑

研究顯示，黃芩、黃柏、黃連以及在麻黃莖中分離得到的原花青素A 對白念珠菌有較強的抑菌效果[41-42]。小檗堿和氟康唑聯(lián)合用藥也顯示對白念珠菌的抑菌效應(yīng)[43]。

3.5 尋找新的作用靶點

對于人體內(nèi)沒有而真菌細胞必不可少的代謝途徑，可以開發(fā)藥物阻斷其代謝，不會對人體造成損傷。如ASP2397 通過靶向人體不具有而在真菌細胞中存在的鐵轉(zhuǎn)運蛋白而發(fā)揮藥效[44-45]。

3.6 抗真菌藥物的合理使用

相比抗細菌、抗病毒藥物，抗真菌藥物種類雖不多，但各個藥物具有其特定的抗菌譜，例如隱球菌對棘白菌素類抗真菌藥耐藥，毛霉對棘白菌素類和吡咯類均耐藥；此外，同一藥物在體內(nèi)針對不同組織部位的感染也具有特定的濃度，例如氟康唑在尿路的藥物濃度是血液中的10 倍以上，卡泊芬凈在肝腎的藥物濃度是血液中的5 倍以上，而在腦脊液中濃度極低[46]。因此，選擇合適的藥物種類和劑量就顯得尤為重要，不合理的臨床用藥不但會耽誤病程、給患者帶來嚴重的經(jīng)濟負擔，還會誘導真菌耐藥性的產(chǎn)生。

4 結(jié)語

隨著研究的不斷深入，對真菌耐藥機制的探究有了一定進展，尤其是比較基因組學和轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)等在侵襲性真菌研究中的應(yīng)用，對解析真菌的毒力和耐藥起到重要作用[47-48]。對于某些感染，通過改良藥物或聯(lián)合用藥能取得一定的治療效果，但真菌耐藥的復(fù)雜性不容忽視，也依然有許多耐藥機制不甚明了。2009年，在日本首先發(fā)現(xiàn)了具有強抗藥性的超級真菌——耳念珠菌，隨后在世界多國都有發(fā)現(xiàn)，其不但致死率高而且多重耐藥，研究顯示，幾乎所有的耳念珠菌菌株對氟康唑耐藥，半數(shù)以上對伏立康唑耐藥，三分之一對兩性霉素B 耐藥，少數(shù)對棘白菌素也耐藥[49]；另有研究顯示，耳念珠菌的耐藥性與FKS1、FKS2、CgPDR1、CgCDR1和FCY2這些基因的單核苷酸突變可能存在關(guān)聯(lián)性[24]。但目前對于耳念珠菌感染并沒有有效的治療手段，研究其耐藥機制，研發(fā)相應(yīng)的診斷與治療方法，從而有針對性地靶向用藥，仍是研究者們努力的方向[50]。